Souris fragilitas ossium et mutation de la sphingomyélinase neutre de type 2 : implication dans l'apoptose et l'ostéochondrogenèse

par Raphaël Devillard

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Robert Salvayre.

Soutenue en 2011

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Les sphingolipides sont des lipides complexes, qui rentrent dans la composition des membranes, mais sont également des agents de signalisation majeurs, impliqués dans de nombreuses réponses et régulations cellulaires, et dans la physiopathologie de maladies cardiovasculaires, inflammatoires ou de cancers. Parmi les sphingolipides, le céramide, la sphingosine et la sphingosine 1-phosphate, interviennent dans différents processus biologiques tel que la prolifération, l'apoptose ou la différenciation cellulaire. Leur implication dans l'apoptose, dépend de la nature de l'enzyme (sphingomyélinase) qui dégrade la sphingomyéline en céramide. Dans ce contexte, le rôle de la sphingomyélinase neutre de type 2 (nSMase2) dans l'apoptose, est actuellement débattu. Le rôle des sphingolipides dans le développement osseux n'est pas connu. Cependant, les modèles animaux mutants pour la nSMase2 présentent une altération de la chondrogenèse et/ou de l'ostéogenèse. Le modèle murin fragilitas ossium (fro/fro), présente une mutation autosomale récessive du gène smpd3 codant pour la nSMase2, ce qui induit la synthèse d'une enzyme non fonctionnelle. Cette mutation est associée à un phénotype d'ostéogénèse et de dentinogénèse imparfaite, caractérisé par des malformations des os longs, une diminution de la minéralisation de la matrice extracellulaire et une forte mortalité néonatale, sans mutation du collagène de type I (mutation la plus fréquente chez l'homme et associée aux formes cliniques d'osteogenesis imperfecta). Le modèle fro/fro pose la question du rôle de nSMase2 dans l'ostéochondrogenèse. L'objectif de cette thèse a été d'étudier d'une part le rôle de la nSMase2 dans l'apoptose des cellules mésenchymateuses induite par les agents de stress, et d'autre part le mécanisme reliant le défaut en nSMase2, la voie des sphingolipides et le phénotype de la souris fragilitas ossium. Dans la première partie, nous rapportons que l'apoptose induite par les agents de stress (LDL oxydées, TNF-alpha) sur des fibroblastes n'est pas ralentie dans les fibroblastes issus de souris fro/fro. De même ces animaux ne sont pas plus résistants à l'atteinte hépatique induite par le TNF-alpha. A l'inverse, la nSMase2 favoriserait la prolifération des cellules mésenchymateuses. Dans une deuxième partie, nous avons par microarray, montré que la mutation de smpd3 n'affecte pas l'expression de gènes de l'ostéochondrogenèse, tels que Runx2, osterix et COL1A1. Nous avons étudié le rôle des métalloprotéases (MMPs) et de la nSMase2 (dont l'activation dépend de MMP2), sur la formation des vésicules de minéralisation ostéoblastiques. Nos résultats montrent que la formation et la minéralisation de ces vésicules sont inhibées par le Ro28-2653, un inhibiteur pharmacologique des MMPs, mais pas par l'inhibiteur spécifique de nSMase2, GW4869. Ces résultats obtenus dans la lignée pré-ostéoblastique MC3T3-E1, ont été confirmés pour la minéralisation de pré-ostéoblastes issus de souris fro/fro, suggérant donc que la nSMase2 n'agit pas à ce stade de l'ostéochondrogenèse. En conclusion, la nSMase2 participe à la prolifération des cellules mésenchymateuses, mais pas à l'apoptose induite par les agents de stress. Les MMPs sont impliquées dans la formation des vésicules de minéralisation osseuse, mais le déficit en nSMase2 n'intervient pas à ce stade de l'ossification. Les travaux actuels et les perspectives s'orientent vers un rôle pour la nSMase2 dans la maturation des chondrocytes.

  • Titre traduit

    Fragilitas ossium mouse and neutral sphingomyelinase type 2 utation


  • Résumé

    Beside their place in the structure and composition of membranes, sphingolipids are considered as major signalling agents involved in various biological processes such as proliferation, apoptosis or cell differentiation, in the pathophysiology of inflammatory. The role of sphingolipids (mainly ceramide) in apoptosis depends on the nature of the sphingomyelinase, and the role of the neutral type 2 sphingomyelinase (nSMase2), in this process is debated. The implication of sphingolipids in osteochondrogenesis is not known so far. However animal models affected with nSMase2 deficiency exhibit strong alteration in bone formation, suggesting a role for sphingolipids in osteochondrogenesis. We have particularly studied the murine fragilitas ossium (fro/fro) mouse model, which is due to a recessive mutation of the smpd3 gene, resulting in a deficiency in nSMase2 enzyme activity. This mutation is associated with an osteodentinogenesis imperfecta-like phenotype, characterized by long bone malformations, a decrease in extracellular matrix mineralization and a high perinatal mortality, without collagen type I defect (which is the most frequent cause of osteogenesis imperfecta in humans. ) The fro/fro phenotype suggests a role for nSMase 2 in osteochondrogenesis. The objective of this study was to investigate the implication of nSMase2 in apoptosis induced by stress-inducing agents, and the mechanisms linking nSMase2 mutation, the sphingolipid pathway and the fragilitas ossium phenotype. In the first part, we report that the mutation of nSMase2 has no effect on mesenchymous cell apoptosis induced by stress-inducing agents (oxidized LDL, TNF-a). Likewise, fro/fro mice do not exhibit any delayed mortality resulting from hepatitis induced by TNF-alpha injection. At the opposite, the lack of nSMase2 results in a decreased cell proliferation that is restored when transfecting a plasmid encoding nSMase2 promoted cell proliferation. In the second part, we have performed microarray studies to check the consequences of nSMase2 mutation on the expression of genes involved in osteochondrogenesis, particularly Runx2, osterix, COL1A1, which are not affected by nSMase2 mutation. We then studied the implication of metalloproteases (MMPs) and of nSMase2 (which is activated via MMP2), on the formation of matrix mineralization vesicles. Our results indicate that the formation and the mineralization of matrix vesicles are inhibited by Ro28-2653, a pharmacological inhibitor of MMPs, but not by the nSMase2 inhibitor, GW4869. These results obtained in the pre-osteoblastic cell line MC3T3-E1, are confirmed when studying the mineralization of pre-osteoblasts prepared from fro/fro, mice, thereby indicating that nSMase2 is not involved at this step of osteochondrogenesis. In conclusion, nSMase2 is involved in the proliferation of mesenchymous cells, but not in apoptosis evoked by stress-inducing agents. The formation and mineralization of matrix vesicles does not require nSMase2, while MMPs are involved. Preliminary data and perspectives suggest that nSMase2 could play a role in the maturation of chondrocytes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (147 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 110-131

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2011 TOU3 0227
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 8701
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