Insights into the selenocysteine incorporation mechanism in mammals

par Olga Kossinova

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Galina Karpova et de Alain Krol.

Soutenue en 2011

à Strasbourg .

  • Titre traduit

    Biosynthèse des sélénoprotéines : interactions ARN messager-protéins-ribosome


  • Résumé

    L'acide aminé sélénocystéine est codé par UGA qui agit généralement comme un codon stop. Une machinerie spécialisée est utilisée pour incorporer cet acide aminé dans les sélénoprotéines qui implique une structure en tige-boucle, appelée SECIS, et des protéines. L'une d’elles est SBP2, SECIS Binding Protein 2. Pour mieux comprendre ce mécanisme et identifier de nouveaux partenaires de l'élément SECIS, deux stratégies ont été développées. 1/ identification des contacts de l’élément SECIS avec le ribosome par des pontages covalents. Dans ce but, j’ai construit des ARN messagers modèles, l’élément SECIS contenant des agents pontants. Après action des UV, il s’avère que SBP2 est liée au SECIS dans les complexes 48S et 80S de pré-translocation. Lorsque la formation de la liaison peptidique est bloquée par l’anisomycine, l’élément SECIS n’est plus lié à SBP2 mais à des protéines ribosomiques, SBP2 étant présente dans le complexe. L'interprétation est la suivante. Pendant la transpeptidation, SBP2 est associée au ribosome mais ensuite SBP2 le quitte et se lie au SECIS à l'étape de pré-translocation. 2/ Le site de liaison de SBP2 sur la sous-unité 60S n’avait pas encore été localisé. Les complexes SBP2-40S, 60S-SBP2 et 80S-SBP2 ont été soumis aux diépoxybutane ou 2-iminothiolane. Nous avons montré que SBP2 se lie à la sous-unité 60S uniquement et que l'ARNr 28S contribue davantage au site de liaison que les protéines ribosomiques. Pour identifier cette région de l’ARNr 28S, les radicaux hydroxyles ont été employés et nous avons montré que SBP2 réside sur le côté solvant de la sous-unité 60S, à proximité du site A.


  • Résumé

    The amino acid selenocysteine is encoded by a UGA triplet which acts generally as a stop codon. A specialized machinery is used to incorporate this amino acid into selenoproteins, involving a specific stem-loop, termed SelenoCysteine Insertion Sequence (SECIS), and some protein factors. One of those is the SECIS Binding Protein 2 (SBP2), which is necessary for ribosome recognition of the UGA as the Sec codon. Using synthetic selenocysteine mRNAs and translational inhibitors, several steps of mRNA translation were analyzed. The data obtained allowed us to propose the following mechanism for selenocysteine insertion : during the transpeptidation step of elongation, SBP2 is bound to the ribosome; however, after transpeptidation, SBP2 leaves the ribosome and binds the SECIS in the pre-translocation step. We showed earlier that SBP2 binds specifically to the purified human 60S but not to the 40S ribosome subunits but the actual location was unknown. The SBP2•40S, SBP2•60S and SBP2•80S complexes were thus studied using crosslinking reagents. SBP2 did not crosslink to the 40S subunit in either the 40S•SBP2 or 80S•SBP2 complexes, correlating with the binding data. However, SBP2 crosslinks to the 60S subunit in either the free state or in the 80S ribosome. I next showed that the 28S rRNA contributes more to the crosslink than ribosomal proteins. This led us to use hydroxyl radical footprinting to study the molecular environment of SBP2 on the ribosome. According to the probing data, the binding of SBP2 to the human 60S subunit protects 2 helices in expansion segment 7 of the 28S rRNA. I proposed that the SBP2 binding site is located in the vicinity of the L7/L12 stalk.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (118 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 105-120

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2011;1192
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