New methodologies of solid state NMR and biophysical studies of antimicrobial and designed peptides in model and natural membranes

par Barbara Perrone

Thèse de doctorat en Biophysique

Sous la direction de Burkhard Bechinger.

Soutenue en 2011

à Strasbourg .

  • Titre traduit

    Nouvelles méthodologies de la RMN de l'état solide et études biophysiques sur des peptides antimicrobiens et de synthèse dans des membranes modèles et naturelles


  • Résumé

    La spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire des solides est un outil puissant pour l’étude structurale des peptides membranaires. L'angle d'inclinaison par rapport à la membrane de peptides structurés en hélice peut être obtenu par l’analyse des spectres de poudre provenant de systèmes non-orientés par rapport au champ magnétique statique. Cette approche permet un meilleur contrôle sur plusieurs paramètres par rapport aux systèmes orientés. Cependant, les spectres de poudre de ces systèmes présentent d’importantes distorsions à proximité du déplacement chimique isotrope (Magic Angle Hole, MAH) qui empêchent d'atteindre une qualité satisfaisante des paramètres RMN mesurés. Dans ce travail de thèse nous avons développé une nouvelle méthode qui récupère la forme théorique des spectres de poudre : l’expérience RODEO (ROtor-Directed Exchange of Orientations). La méthode a été appliquée avec succès à des peptides insérés dans des membranes models. Enfin nous avons appliquée l’expérience RODEO à un mélange de lipides extraits de membranes naturelles, et, pour la première fois, in vivo, dans des bactéries Escherichia coli. Dans la deuxième partie de ce travail, nous rapportons des résultats inattendus sur le mécanisme d'insertion du peptide antimicrobien LAH4. Il a été précédemment montré que l'hélice LAH4 est orientée parallèlement à la surface de la membrane dans des conditions acides, tandis que, à pH neutre, le peptide adopte une orientation trans-membranaire. En revanche, nous avons constaté que lorsque le tampon citrate est ajouté pour réguler le pH à 5, le peptide s’insère de manière transmembranaire. Quelques explications possibles sont proposées.


  • Résumé

    Solid-state NMR (SS-NMR) spectroscopy is a powerful tool to investigate structural details of membrane-associated peptides. In particular, the tilt angle of helical peptides reconstituted in non-oriented membranes can be derived by line-shape analysis of ^{15}N powder patterns. This approach allow a better control on several parameters with respect oriented SS-NMR spectroscopy. The spectra of peptides undergoing to fast uniaxial rotation diffusion around the membrane normal are characterized by distortions close to the isotropic chemical shift (Magic Angle Hole, MAH) that prevent to reach a satisfying fit quality. We developed a method that recovers the theoretical powder pattern line-shape based on ROtor-Directed Exchange of Orientations Cross-Polarization (RODEO). The method was successfully applied to designed peptides in unoriented membranes resulting in tilt angles values in agreement with published data. RODEO was applied also to complex membrane systems, such as lipid mixture extracted from natural membranes, and, for the first time, we obtained an estimation of the alignment of an antimicrobial peptide in vivo. In the second part of this work, we report some unexpected results of biophysical investigations conducted to elucidate the insertion mechanism of the antimicrobial peptide LAH4 in zwitterionic membranes. It was previously shown that the LAH4-helix adopts an in-plane orientation in acidic conditions, while, at neutral pH, the peptide adopts a trans-membrane orientation. In contrast, we found that when citrate buffer is added to regulate the pH at 5, the peptide inserts in a transmembrane manner. Some possible explanations are suggested.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (XXVIII-146 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 10 p.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2011;1093
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