Production du peptide P-LAH4 chez E. Coli et études par RMN de ses propriétés antibactérienne et de transfection d’ADN

par Verica Vidovic

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Burkhard Bechinger.

Soutenue en 2011

à Strasbourg .


  • Résumé

    LAH4 est un peptide antibactérien de 26 acides aminés capable de se complexer à l’ADN et de permettre son transfert dans les cellules eucaryotes. Nous avons développé une stratégie d’expression chez E. Coli qui permet la production de 10mg de peptide P-LAH4 purifiés et marqués en 15N par litre de culture. Malgré l’addition d’une proline, le peptide P-LAH4 conserve son caractère antibactérien et transfectant d’ADN. La structure, la topologie du peptide associé aux membranes, ainsi que ses interactions avec l’ADN ont été étudiées par RMN. L’étude de sa structure dans des micelles de DPC à pH=5,5 a permis l’attribution des résonances des noyaux NH, HN, Cα, Cβ et Hα pour 90 % des résidus. Le peptide adopte une conformation en hélice αdes résidus A4 à A23. Les études par RMN 15N du peptide reconstitué dans les bicouches orientées de POPC à pH=5,5 et 6,9, indique qu’il est orienté parallèlement à la membrane à pH=5,5 et incliné d’environ 10° par rapport à la normale à la bicouche à pH=6,9. De plus, il adopte également une structure en hélice α dans les bicouches aux deux pH. La technique REDOR appliquée sur les complexes P-LAH4/ADN à pH=5 montre que les résidus lysines sont proches des noyaux 31P de l’ADN, contrairement aux résidus histidines, ce qui suggère un modèle d’interaction dans lequel le peptide agirait avec l’ADN par l’intermédiaire d’interactions électrostatiques via ces extrémités. Le marquage sélectif en 13C/15N sur chacune des quatre lysines séparément révèle que les lysines 2 et 25 sont les résidus « moteurs » dans l’interaction avec l’ADN.

  • Titre traduit

    Structural investigations of peptide-DNA transfection complexes : Bacterial overexpression and isotopic labelling of peptides, biophysical and NMR investigations


  • Résumé

    LAH4 is a 26 amino acids antimicrobial peptide which has the ability to complex with DNA and to transfect eukaryotic cells. Here, we have described a procedure that allows rapid expression and purification of P-LAH4. The final yield obtained is 10mg of P-LAH4 uniformly 15N labeled per liter of culture. We have also shown that in spite of the proline’s addition in the N-terminus of the peptide, P-LAH4 maintains its antibacterial activity against E. Coli and is able to transfect DNA in a manner comparable with LAH4. The structure, topology of the peptide in interaction with model membranes and with DNA was investigated using NMR spectroscopy. Firstly, the NH, HN, Cα, Cβ and Hαchemicals shift of 90% of the peptide residues was determined when the peptide interacts with DPC micelles at pH=5. 5 and consequently we have shown that the peptide adopts an alpha-helical conformation from A4 to A23. Secondly, we have reconstituted the peptide in oriented POPC membranes at pH=5. 5 and 6. 9. The results indicate that the peptide is oriented parallel to the membrane at pH=5. 5 and that at pH=6. 9 it is 10° tilted to magnetic field. It also adopts an alpha helical structure at both conditions. Thirdly, application of REDOR NMR in DNA/LAH4 complexes at pH=5 reveals that the lysine side chains are close to 31P of the DNA in contrast to the histidine side chains which are not involved in significant dipolar coupling with 31P. The data suggest that the peptide interacts with DNA by electrostatic interactions via its extremities. The peptide was finally labeled at only one lysine site and the results indicate that the lysine 2 and 25 act as “driving residues” during the formation of complexes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (228 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 197-212

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2011;1063
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