Protection de la vigne contre Botrytis cinerea via la stimulation des défenses : identification de marqueurs de protection et de potentialisation par approche protéomique

par Bertrand Delaunois

Thèse de doctorat en Sciences - STS

Sous la direction de Philippe Jeandet.

Soutenue le 18-11-2011

à Reims , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences, technologies, santé (Reims, Marne) , en partenariat avec Unité de Recherche sur la Vigne et le Vin de Champagne - URVVC (laboratoire) .

Le président du jury était Fabienne Baillieul.

Le jury était composé de Philippe Jeandet, Dominique Job, Sylvain Cordelier.

Les rapporteurs étaient Brigitte Mauch mani, Pierre Coutos thevenot.


  • Résumé

    La pourriture grise causée par Botrytis cinerea est l'une des principales maladies de la vigne. La principale solution pour faire face à cette maladie est l'utilisation de produits chimiques, mais la lutte chimique cause des dommages environnementaux et conduit au développement de souches de B. cinerea résistantes. Une stratégie alternative consiste à stimuler les mécanismes de défense naturelle de la vigne. Cependant, B. cinerea est connu pour contourner les défenses de la plante (El Oirdi et Bouarab, 2011) et à ce jour aucun éliciteur n'a montré d'effet protecteur probant contre B. cinerea. De plus, les résultats prometteurs observés au laboratoire se révèlent souvent décevants au vignoble et à ce jour aucun produit stimulateur de défense ne confère à la vigne une protection acceptable contre la pourriture grise. Pour développer des éliciteurs efficaces contre la pourriture grise, il s'avère donc essentiel de caractériser des marqueurs de protection qui permettraient de distinguer stimulation des défenses et protection efficace de la vigne contre B. cinerea. Pour ce faire des analyses comparatives ont été réalisées par 2D-PAGE afin de comparer au niveau protéique l'effet d'éliciteurs induisant une protection et l'effet d'éliciteur n'induisant pas une protection. Les recherches se sont concentrées sur l'apoplaste, qui est un réseau continu dans les plantes créant une interface avec l'environnement. Après la cuticule, l'apoplaste est ainsi la première barrière contre les attaques d'agents pathogènes (Agrawal et al., 2010). Afin d'obtenir un aperçu du protéome constitutif de l'apoplaste (secrétome), une méthode d'infiltration-centrifugation a été optimisée afin de recueillir le fluide apoplastique à partir de feuilles de vigne. Les profils protéiques apoplastiques ont ensuite été comparés aux profils protéiques de feuilles entières par 2D-PAGE et les protéines identifiées par spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d'établir une carte protéique des feuilles entières et du secrétome de la vigne. A notre connaissance, cette étude fournit la première carte protéique du secrétome de la vigne. Cette étude nous donne ainsi un aperçu des protéines les plus abondantes de l'apoplaste de feuilles de vigne. Une prédiction de la fonction des protéines nous a permis de conclure que l'apoplaste de vigne contient principalement (i) des protéines liées aux stress, (ii) des protéines impliquées dans le métabolisme de la paroi cellulaire et (iii) des protéases. Pour confirmer la qualité des extractions, l'analyse prédictionnelle de la sécrétion des protéines a révélé une forte proportion de protéines secrétées de manière classique et non classique (Leaderless Secreted Proteins, LSP). Cette approche offre un grand nombre de protéines candidates impliquées dans les diverses fonctions physiologiques de l'apoplaste. (…)Parallèlement cette étude présente les travaux préliminaires entrepris, également par 2D-PAGE, pour (i) mettre en évidence des marqueurs de potentialisation chez la vigne, (ii) mettre en évidence les bouleversements, au niveau protéique, causés par une infection de B. cinerea sur la vigne et (iii) comprendre comment un traitement avec un éliciteur protecteur pourrait limiter ces effets néfastes. La validation de ces marqueurs par différentes approches permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes de défense des plantes et le développement d'outils pour le criblage de nouveaux éliciteurs candidats pour leurs effets protecteurs contre la pourriture grise et pour le suivi des défenses de la vigne directement au vignoble.

  • Titre traduit

    Grapevine protection against Botrytis cinerea by plant defense stimulation : identification of protection and potentiation biomarkers by proteomic approach


  • Résumé

    Grey mould caused by Botrytis cinerea infection is one of the main diseases affecting grapevine. The main solution to cope with this disease is the use of chemicals, but chemical control cause environmental damages and lead to the development of B. cinerea resistant strains. An alternative strategy to prevent diseases consists in stimulating plant defense mechanisms. Nevertheless B. cinerea is known to manipulate plant defenses (El Oirdi and Bouarab, 2011) and to date no elicitors have shown expected protective effect against B. cinerea even if they stimulate defense markers. Moreover despite that numerous studies showed an excellent efficacy of elicitors in laboratory conditions, in vineyard the obtained results are often disappointing.Thus it is necessary to distinguished elicitors inducing protection (protective elicitor) from elicitors inducing defense but no protection (non protective elicitors). For that it appears crucial to characterize markers which would enable to discriminate grapevine defense stimulation from effective protection against B. cinerea. To reach this goal, comparative analyses were performed by 2D-PAGE in order to compare the effect of protective elicitors from non protective elicitors against B. cinerea on grapevine apoplastic fluids. Those biomarkers could be defined as protection biomarkers.Researches were focused on the apoplast, which is a continuous network in plants and creates an interface with the environment. After the cuticle, apoplast is the first barrier against pathogen attacks (Agrawal et al., 2010). In order to obtain an overview of the constitutive apoplastic proteome (secretome), a vacuum-infiltration-centrifugation method was optimized to collect the apoplastic fluid from grapevine leaves. Apoplastic protein profiles were compared to whole-leaf protein profiles by 2D-PAGE and protein identifications were performed by tandem mass spectrometry. This approach allowed us to establish a well-defined proteomic map of whole-leaf and apoplastic leaf. To our knowledge, it is the first time that the apoplastic fluid is recovered from grapevine to characterize its protein content. This study provides a comprehensive overview of the most abundant proteins present in grapevine apoplast. Protein function prediction allowed us to conclude that the grapevine apoplast mainly contains a high proportion of (i) stress-related proteins, (ii) proteins involved in cell wall metabolism, (iii) proteases. To confirm quality of extractions, proteins secretion prediction tools revealed a high proportion of classical and non-classical secreted proteins namely Leaderless Secreted Proteins (LSP). This approach provides thus a large number of candidate proteins involved in physiological functions of the apoplast under various stresses.Differential analyses let us to highlight 7 putative markers, namely an aspartyl protease, a β-1,3 glucanase, an isoflavone reductase for induced markers and an another aspartyl protease, an another β-1,3 glucanase, a germin-like protein and a serine pyruvate amino transferase for repressed markers. This proteins could act in a concert manner to (i) regulate reactive oxygen species homeostasy and dercease programmed cell death, (ii) counteract B. cinerea virulence factors, (iii) increase plant cell wall stiffening, (iv) cause fungal membrane leakage and (v) participate in the induction of systemic defence responses.In addition, this study provides preliminary research performed to highlight (i) priming biomarkers in grapevine, (ii) damages caused by B. cinerea infection on grapevine proteome and (iii) how a protective elicitor treatment could limit those damages.Further functional analyses of these proteins will improve the understanding of plant defense mechanisms and tools development for large scale screening of new elicitors regarding their protective effects against grey mould disease and for following grapevine defenses in vineyard.


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