Sources des mycobactéries non-tuberculeuses dans les bassins versants

par Nicolas Radomski

Thèse de doctorat en Sciences et Techniques de l'Environnement

Sous la direction de Régis Moilleron.

Le président du jury était Daniel Thévenot.

Le jury était composé de Régis Moilleron, Françoise Solange Lucas, Emmanuelle Cambau, Joseph Oliver Falkinham III, Laurent Moulin.

Les rapporteurs étaient Benoît Cournoyer, Christophe Sola.


  • Résumé

    L'eau et le sol sont considérés comme des sources potentielles de mycobactéries non-tuberculeuses (MNT). Parmi les infections humaines causées par les MNT d'origine environnementale, les infections pulmonaires et cutanées sont souvent décrites. Le manque de connaissances sur leur cycle de vie dans l'environnement requiert des outils analytiques, qui ne sont actuellement pas adaptés à ce type d'échantillons. Cette thèse vise donc premièrement à proposer des méthodes de quantification en bactériologie et en biologie moléculaire dans le but de déterminer les sources des MNT dans les bassins versants. Ainsi, la comparaison des méthodes d'isolement de MNT a montré que le traitement au chlorure de cetylpyridininium de l'eau suivi d'une culture en milieu riche supplémenté par un mélange d'antibiotiques (polymyxine B, amphotéricine, acide nalidixique, triméthoprime, carboxy-pénicilline) limitait la croissance des microorganismes interférents et éliminait moins de MNT que les autres méthodes comparées (Radomski et al. 2010, doi: 10.1128/AEM.00942-10). Bien que des espèces de MNT potentiellement pathogènes aient été isolées de l'eau de surface de la Seine en utilisant ces outils bactériologiques, la quantification des MNT ne s'est pas avérée reproductible. En conséquence, une méthode de quantification par polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR) a été développée pour énumérer le genre Mycobacterium dans l'eau (Radomski et al. 2010, doi: 10.1128/AEM.02659-09). La nouvelle méthode développée, ciblant l'ARNr 16S, était plus spécifique que les autres méthodes qPCR publiées, ciblant un autre locus de l'ARNr 16S et le gène hsp65 (respectivement 100 % versus 44 % et 91 %). La comparaison des méthodes d'extraction d'ADN mycobactérien a montré que la lyse enzymatique combinée au bromure d'hexadécyltriméthylammonium était la procédure la plus efficace pour énumérer par qPCR les MNT dans des échantillons environnementaux. Ainsi, ces méthodes d'extraction d'ADN et de qPCR ont été utilisées pour étudier des sources de MNT dans des bassins versants. Dans un second temps, nous avons étudié trois sources potentielles de MNT : une ponctuelle et deux diffuses. Plus précisément, une station d'épuration (STEP) a été choisie comme source ponctuelle de MNT et a été étudiée en temps sec en fonction d'indicateurs de contamination fécale et des paramètres globaux habituellement contrôlés. Les MNT ont atteint 5,52×105±3,97×105 copies/L dans l'eau en entrée de STEP (84 % d'échantillons positifs), n'ont pas été détectées dans l'eau en sortie de STEP après décantation physico-chimique et biofiltration et ont été estimées à 1,04×106 ±1,75×106 copies/g dans les boues de STEP (50 % d'échantillons positifs). La plupart des MNT (98±2 %, correspondant à 2,45±0,78 log10) ont été éliminées par décantation physico-chimique et les MNT restantes (0,74×104 ±1,40×104 copies/L) ont été éliminées par biofiltration (53 % d'échantillons positifs). Ces résultats ont montré également que Mycobacterium, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux possèdent des comportements significativement différents conduisant respectivement à trois modèles : hydrophobe, hydrophile et intermédiaire. Concernant les sources diffuses, la densité de MNT a été mesurée dans divers sols ruraux et urbains qui ont été caractérisés par différents paramètres physico-chimiques. Les densités de MNT les plus importantes ont été mesurées dans des sols de forêts tourbeuses (9,27×104±5,00×104 copies/g sec) et dans des sols faiblement urbanisés proches de marécages côtiers (1,71×106±2,85×106 copies/g sec) alors qu'aucune MNT n'a été détectée dans les autres types de sols étudiés. De plus, la densité de MNT a été significativement associée à des sols proches de zones acides et des teneurs fortes des sols en eau, matière organique et fer. Ces résultats suggéreraient que les MNT sont dépendantes de leur production intra et extracellulaire de chélateurs de fer et indiqueraient que les zones faiblement urbanisées pourraient être impactées par la proximité de marais acides. Afin d'étudier une autre source diffuse, les MNT et d'autres paramètres ont été mesurés lors d'événements pluvieux dans l'eau de surface de la Marne et de ses principaux affluents. Les densités de MNT ont été estimées à 2,16×105±2,36×105 copies/L dans environ 20 % des échantillons d'eau collectés, et elles ne différaient pas entre les zones péri-urbaines et rurales échantillonnées. Nos résultats ont montré que la pluviométrie et la durée de l'évènement expliquaient la diminution du nombre de MNT détectées dans l'eau de surface au cours de l'événement pluvieux de faible intensité (6,6 mm/h de pluviométrie cumulées en 5,5 h). Ces résultats ont souligné que certains affluents de la Marne pouvaient apporter des MNT en temps sec, mais qu'au cours de l'évènement pluvieux suivi les densités de MNT diminuaient.En guise d'amélioration à ces études appliquées, des réflexions sur les défis relatifs à la surveillance des microorganismes pathogènes dans l'environnement ont été explorées. En nous focalisant sur la MNT la plus pathogène, M. avium, nous avons discuté des défis de la détection et de l'énumération et proposé un guide d'adaptation des méthodes médicales aux échantillons environnementaux (Radomski et al. 2011, ed. A. Méndez-Vilas, Vol. 2). Ce guide se présente sous la forme d'un arbre de décision permettant de choisir les outils analytiques les plus appropriés pour surveiller les microorganismes pathogènes dans l'environnement. De plus, une stratégie in silico de comparaison de génomes bactériens totalement séquencés a été développée dans le but de décrire des nouvelles cibles de détection. L'analyse in silico des génomes totalement séquencés a permis de détecter 11 protéines présentant entre 80 % et 100 % de similarité dans les génomes mycobactériens et moins de 50 % de similarité dans les génomes non-mycobactériens des genres Corynebacterium, Nocardia et Rhodococcus. Sur la base d'alignements des séquences d'ADN de ces cibles potentielles, il a été possible de dessiner des amorces PCR et une sonde pour détecter le gène codant la sous-unité C de la synthase de l'adénosine triphosphate qui semble exclusivement conservée dans le génome mycobactérien. Le développement d'outils analytiques, en particulier la qPCR, a permis de montrer qu'une STEP éliminait efficacement les MNT et que le traitement des eaux usées est nécessaire pour préserver l'eau de surface de cette source ponctuelle de MNT. Il a été mis en évidence que les événements pluvieux diminuent la densité de MNT dans l'eau de surface et que les sols acides sont des sources naturelles majeures de MNT qui pourraient impacter des zones faiblement urbanisées en temps de pluie via le ruissellement. Concernant les réflexions sur la surveillance des microorganismes pathogènes dans l'environnement, l'arbre de décision des outils analytiques appropriés et la nouvelle stratégie in silico de détection de cibles moléculaires pourraient être appliqués pour l'étude d'autres microorganismes de l'environnement

  • Titre traduit

    Sources of nontuberculous mycobacteria in watersheds


  • Résumé

    Water and soil are considered as potential sources of nontuberculous mycobacteria (NTM) infections. Among human infections caused by environmental NTM, pulmonary infections and cutaneous infections are often described. However, lack of knowledge about their life cycle in the environment requires analytical tools, which are not currently adapted to these kinds of samples. The aim of this thesis is to propose bacteriological and molecular quantitative methods, in order to determine the sources of NTM in watersheds. Comparison of NTM isolation methods showed that treatment with cetylpyridinium chloride of water, followed by culture on a rich medium supplemented with antibiotic cocktail (polymyxin B, amphotericin, nalidixic acid, de trimethoprim, azlocillin) decreased the growth of nontarget microorganisms, while inhibiting less NTM than the other compared methods (Radomski et al. 2010 doi: 10.1128/AEM.00942-10). Although potentially pathogenic NTM species were isolated from surface water of the Seine River using these bacteriological tools, enumeration of NTM was not reproducible. Consequently, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) method was developed in order to enumerate Mycobacterium spp. in water (Radomski et al. 2010 doi: 10.1128/AEM.02659-09). This newly developed method, targeting 16S rRNA, was more specific than the two previously published qPCR methods targeting another 16S rRNA locus and the hsp65 gene (100% versus 44% and 91%, respectively). Comparison of DNA extraction methods showed that the enzymatic lysis and hexadecyltrimethylammonium bromide procedure was the most effective combination for mycobacterial DNA extraction with the aim to enumerate NTM in environmental samples by qPCR. Thus, these extraction and qPCR methods were used in order to study NTM sources in watersheds.Secondly, we studied three potential sources of NTM : one point source and two nonpoint sources. More precisely, a wastewater treatment plant (WWTP) was chosen as a potential point source of NTM and was studied according to indicators of fecal contamination and usually monitored parameters. NTM reached 5.52×105±3.97×105 copies/L in the influent of WWTP (84% of positive samples). They were not detected in the effluent after physico-chemical decantation and biofiltration, and were estimated at 1.04×106 ±1.75×106 copies/g in sludge (50% of positive samples). Most NTM (98±2%, i.e. 2.45±0.78 log10) were removed by the physical-chemical decantation, and the remaining NTM (0.74×104 ±1.40×104 copies/L) were removed by biofiltration (53% of positive samples). These results showed also that Mycobacterium, Escherichia coli and intestinal enterococci follow significantly different behaviors as hydrophobic, hydrophilic and intermediate models, respectively. Concerning the nonpoint sources, NTM were enumerated in a variety of rural and urban soils which were characterized by different physico-chemical parameters. The highest NTM densities were measured in peat forest soils (9.27×104±5.00×104 copies/g dw) and in lightly urbanized soils near a costal swamp (1.71×106±2.85×106 copies/g dw), whereas they were not detected in the other monitored soils. NTM density was significantly associated with soils near acidic areas and high moisture, organic matter, and iron content in soils. These results emphasized that NTM are dependent upon the production of surface and extracellular iron-binding compounds, and may mean that lightly urbanized area could be impacted by the proximity of the acidic swamp. In order to study another nonpoint source, NTM and other parameters were measured during wet events in surface water of Marne River and their main effluents. NTM density was estimated at 2.16×105±2.36×105 copies/L in about 20% of surface water samples, and NTM densites did not differ among rural and peri-urban sampling areas. Our results showed that the pluviometry and rain duration explained the decrease of detected NTM abundances in surface water during a slightly intense wet event (6.6 mm/h of cumulated rain during 5.5 h). These results emphasized that some tributaries of the Marne River may constitute a source of NTM, however their influence on NTM density in surface water of the Marne River decreased during the slightly intense wet event.In order to improve these applied studies, challenges dealing with pathogenic microorganism monitoring in environment were explored. Focusing on the most pathogenic NTM, M. avium, we discussed the challenges for detection and enumeration and proposed a guidance for the adaptation of clinical methods to environmental samples (Radomski et al. 2010 ed. A. Méndez-Vilas, Vol. 2). This guidance was proposed as a decision tree allowing to choose the most suitable analytical tools in order to monitor pathogenic microorganisms in environment. Moreover, an in silico strategy of whole sequenced bacterial genome comparison was developed in order to describe new targets for NTM detection. In silico analysis of whole sequenced genomes allowed to detect 11 proteins showing between 80% and 100% of similarity with mycobacterial genomes, and less than 50% of similarity with closely related genomes of Corynebacterium, Nocardia and Rhodococcus genera. Based on the DNA sequence alignments of these potential targets, it was possible to design a primer pair and a probe in order to detect by PCR the gene coding for adenosine-5'-triphosphate synthase subunits C which seems exclusively conserved in mycobacterial genome.Using the developed analytical tools, especially the qPCR, we showed that a WWTP removed efficiently NTM from the influent, and that waste water treatment is necessary in order to preserve surface water against this NTM point source. It was shown that storm events decrease NTM densities in surface water and in contrast that acidic soils are major NTM natural sources which may impact lightly urbanized areas during wet weather when runoff water suspends soil matter. Concerning challenges dealing with pathogenic microorganism monitoring in environment, the decision tree of suitable analytical tools and the new in silico strategy of molecular target detection might be also useful for the study of other environmental microorganisms


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