Inactivation stable et contrôlée des sous-unités accessoires du complexe I mitochondrial

par Sandrine Loublier

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Pierre Rustin.

Soutenue en 2011

à Paris 7 .


  • Résumé

    Le déficit en complexe I (CI) est défaut le plus fréquent de la chaîne respiratoire humaine. Jusqu'à récemment, la recherche de mutations chez les patients se limitait souvent aux gènes des sous-unités homologues du CI bactérien. Quelques unes des 31 autres sous-unités, considérées comme accessoires, ont depuis montré qu'elles étaient nécessaires à l'activité catalytique du CI. Afin de connaître systématiquement le rôle des sous-unités accessoires du CI, nous avons souhaité les inactiver dans des lignées cellulaires humaines. Pour cela, on a inséré des séquences codant des ARN interférents dans l'ADN des cellules : soit par un lentivirus (cellules SK-N-AS), soit par recombinaison dans un site Flp (cellules HEK Flp-In). L'effet sur l'activité de la chaîne respiratoire a été mesuré. L'inactivation de NDUFB6 par la méthode lentivirale affecte fortement le CI et le clone le plus atteint présente aussi un fort déficit en complexe IV (CIV). Les clones contrôles ne montrent aucune inactivation du CI mais, pour un sur cinq, une diminution du CIV. La méthode Flp a permis de contrôler le site et le nombre d'insertions. L'inactivation de NDUFV1, dont la mutation est connue pour entraîner un déficit en CI, a permis de valider ce modèle. L'inactivation de NDUFB6 a causé un déficit isolé en CI. L'inactivation de NDUFA2, NDUFV3 et NDUFA8 n'a pas été suffisante pour conclure avec certitude sur l'importance des sous-unités correspondantes dans l'activité du complexe I. En conclusion, si la méthode lentivirale permet d'inactiver un gène cible de manière efficace et stable, elle présente un fort risque d'effets non spécifiques. L'inactivation par la méthode Flp est, elle, stable et contrôlée. Enfin, le gène NDUFB6 devrait être séquence systématiquement chez les malades atteints d'un déficit isolé en CI.

  • Titre traduit

    Controlled and stable inactivation of mitochondrial complex I supernumerary subunits


  • Résumé

    Complex I (CI) deficiency is the most frequent impairement of human respiratory chain. Until recently, the genetic screening of affected patients was mostly restricted to the 14 homologus of bacterial CI. Some of the 31 other subunits, called supernumerary subunits, have since shown that they may be necessary for CI catalytic activity. To systematically decipher the role CI supernumerary subunits, we aimed to extinct the corresponding genes human cell lines. We integrated interfering RNA coding sequences in their genome, using either a lentivirus (SK-N-AS cell line), or using a Flp recombination (HEK Flp-In cells). The consequences of the extinction on mitochondrial respiratory chain were next analyzed. NDUFB6 inactivation using the lentivirus technique impairs greatly the activity of CI and the most affected clone also harbours a complex IV deficiency. In control cell lines, complex I activity is normal but, in one clone out of five, there is a major complex IV deficiency. The Flp technique has allowed us to control integration site and copies number. NDUFV1 and NDUFA2, whose mutation is known to cause a CI deficiency, have been used to validate the Flp inactivation model. We found that NDUFB6, NDUFA8 and NDUFV3 extinction each cause an isolated CI deficiency. In conclusion, the lentiviral inactivation technique can cause a major and stable gene extinction but there is a remarkable risk of non specific effects. The Flp inactivation technique is efficient and allows the generation of stable, isogenic cell lines. Finally, we suggest that the gene NDUFB6 should be sequenced in ail patients harboring a CI isolated deficiency.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (128 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : réf. p. 118-128

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2011) 213
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