Etude de deux acteurs majeurs des voies de réponse au stress d'enveloppe chez Escherichia coli : la protéase - chaperon périplasmique DegP et l'histidine kinase membranaire CpxA

par Orso Subrini

Thèse de doctorat en Structure, fonction et ingéniérie des protéines

Sous la direction de Jean-Michel Betton.

Soutenue en 2011

à Paris 7 .


  • Résumé

    Ma thèse aura porté son attention sur deux des acteurs centraux des voies de réponses aux stress d'enveloppe chez E coli : la protéase - chaperon périplasmique DegP et l'histidine kinase CpxA. Dans un premier temps, j'ai isolé et étudié des complexes formés in vivo entre un variant protéolytiquement inactif de DegP et des substrats physiologiques (les porines OmpC et OmpF). Ces études m'ont permis de déterminer que l'interaction de DegP avec ses substrats nécessite une réorganisation de la structure oligomérique. J'ai également caractérisé l'activité protéase de DegP et déterminé la spécificité de clivage. Enfin, j'ai étudié l'effet chaperon de DegP, in vivo comme in vitro, sur des mutants de la protéine périplasmique MalE affectés dans leur repliement. Ces données suggèrent qu'un même substrat peut à la fois être la cible de l'activité protéase et chaperon. J'ai également caractérisé la structure oligomérique de l'histidine kinase membranaire CpxA en détergent par ultracentrifugation analytique. Ces résultats démontrent que CpxA existe sous différents oligomères dont le trimère de dimère serait la forme majoritaire. Afin de poursuivre une étude fonctionnelle plus détaillée, j'ai reconstitué le système Cpx in vitro dans un modèle mimétique de membrane : le nanodisc. Réinsérée dans une bicouche lipidique, la protéine est plus « fonctionnelle » que dans des micelles de détergents et le phosphotransfert de CpxA vers son régulateur de réponse CpxR est inhibé par la présence de CpxP, un effet non observé en détergent. Ces études devraient permettre de caractériser plus finement les différentes activités contrôlées par CpxA sans l'effet délétère du détergent.

  • Titre traduit

    Studies on two majors proteins involved in Escherichia coli extracytoplasmic stress response : the chaperon protease DegP and the membrane histidine kinase CpxA


  • Résumé

    During my PhD, I have conducted biochemical analysis on two major proteins involved in the extracytoplasmic stress responses in E coli : the periplasmic chaperone - protease DegP and the histidine kinase CpxA. In the first part of the project, I have isolated complexes made in vivo between a proteolytic defective mutant of DegP and the porine OmpC and OmpF. This allowed me to determine that DegP needs a complete oligomeric restructuration to interact with its substrates. I have also caracterized DegP protéase activity and determine its cleavage specificity. Finally, I have studied DegP chaperon activity towards Maltose Binding Protein folding mutants both in vivo and in vitro. Depending of their ability to fold, I showed that a same substrate can be both the target of DegP protease or chaperon activity. In the second part of the project, I have determined the oligomeric structure of CpxA in detergent micelles by analytical ultracentrifugation. These results showed that CpxA in solution exists as different oligomers with the trimer of dimer being the main species. To get insight into CpxA enzymatic activities, I reconstitued the Cpx System in vitro using the nanodiscs technology. Inserted in this membrane mimetic environment, CpxA activity is inhibited by CpxP, an effect which was not observed in detergent. This study should be the beginning of a more detailed analysis of the enzymatic mechanisms involved in this important class of bacterial transducing pathway, without the deleterious effect of detergents.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (210 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 372 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2011) 107
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