Elaboration d'un outil de modification génétique au locus Dct dans les cellules souches embryonnaires de souris à l'aide de la méganucléase I-SceI

par Myriam Fenina

Thèse de doctorat en Science de la vie

Sous la direction de Jean-Jacques Panthier.

Soutenue en 2011

à Paris 6 .


  • Résumé

    De nombreux gènes sont surexprimés au cours de la progression du mélanome malin cutané. Pour mieux comprendre le rôle de ces gènes, des études fonctionnelles sont nécessaires. Mon projet visait à développer une nouvelle stratégie pour produire des souris portant n’importe quel ADN d’intérêt inséré à la place du premier exon du gène Dct. Dct code la dopachrome tautomérase, une enzyme de la voie de biosynthèse de la mélanine, exprimée de façon spécifique dans les mélanocytes et leurs précurseurs. Notre stratégie visait à augmenter la fréquence de recombinaison homologue au locus Dct dans des cellules souches embryonnaires (ES) en induisant une cassure double-brin à ce locus grâce aux propriétés endonucléases de la méganucléase I-SceI de levure. Nous avons créé une lignée de cellule ES qui portent un site unique de reconnaissance de la méganucléase I-SceI inséré dans l’intron 1 du gène Dct. Notre hypothèse était que l’induction d’une cassure double-brin au locus Dct serait recombinogène, et qu’en présence d’une matrice de réparation, la fréquence des recombinaisons homologues à ce locus serait augmentée de façon significative. Nous avons testé cette hypothèse et intégré successivement les gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry au locus Dct. Nos résultats indiquent que, de façon surprenante, l’induction d’une cassure double-brin ne favorise pas la recombinaison homologue au locus Dct. Nous avons analysé l’expression des gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry insérés au locus Dct dans des cellules en culture, l’embryon ou chez l’adulte

  • Titre traduit

    Development of a tool for the genetic modification at the Dct locus in mouse embryonic stem cells using the meganuclease I-SceI


  • Résumé

    Many genes are upregulated during the progression of cutaneous malignant melanoma. To better understand the role of these genes, functional studies are needed. Our project aimed at developing a new strategy to produce mice carrying virtually any DNA sequence of interest inserted in place of the first exon of the Dct gene. Dct encodes dopachrome tautomerase, a melanogenic enzyme expressed in melanocytes and their precursors. Our goal was to increase the frequency of homologous recombination at the Dct locus in embryonic stem cells (ES) by inducing double-strand break (DSB) at this locus using the endonuclease properties of the yeast I-SceI meganuclease. We produced an ES cell line in which a single I-SceI recognition site was inserted into the first intron of the Dct gene. Our hypothesis was that inducing a double-strand break at the Dct locus would be recombinogenic, and that, in presence of a repair template, the frequency of homologous recombination would increase significantly. We tested this hypothesis and integrated successively the reporter genes, Lago1 and the H2B-mCherry, at the Dct locus. Our data indicate that, surprisingly, induction of DSB does not promote homologous recombination at the Dct locus. We analyzed the expression pattern of the reporter genes, Lago1 and the H2B-mCherry, inserted at the Dct locus in cultured cells, embryos or adults

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Informations

  • Détails : 1 vol. ([202] p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 160-173. 281 réf. bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
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  • Cote : T Paris 6 2011 491
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