Le virus de l'hépatite delta : implication du stress oxydant, de STAT-3 et de NF-kappaB dans la pathogénèse virale

par Ségolène Brichler

Thèse de doctorat en Virologie

Sous la direction de Dina Kremsdorf et de Emmanuel Gordien.

Soutenue en 2011

à Paris 5 .


  • Résumé

    Le virus de l'hépatite delta (VHD) est un satellite du virus de l’hépatite B (VHB). Il utilise les protéines d’enveloppe de ce dernier pour former ses particules virales. Le génome du VHD code deux protéines, p24 (ou petite protéine sHDAg) et p27 (ou grande protéine LHDAg), à partir d’une seule phase de lecture ouverte située sur l’antigénome, et ce, grâce à un mécanisme d’édition de l’ARN messager. P24 et p27 sont strictement identiques, exceptés pour les 19 acides aminés additionnels en C-terminal de p27, qui contiennent un site d'isoprénylation sur le résidu cystéine en position 211 (C211). Cette isoprénylation est critique pour l’adressage de la ribonucléoprotéine delta à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), pour son interaction avec les protéines d'enveloppe du VHB et pour l’assemblage et la sécrétion des virions delta. Au cours de l’infection VHB/VHD, on observe en règle générale une inhibition de la réplication du VHB. Cependant, la maladie hépatique qui en résulte est beaucoup plus grave, avec une plus grande fréquence des formes fulminantes, et surtout une progression accélérée vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Les mécanismes de cette aggravation ne sont pas élucidés, mais suggèrent une pathogenèse spécifique liée au VHD. Afin d’explorer ces questions, nous avons utilisé un modèle de transfection transitoire de cellules hépatocytaires Huh7, à l’aide de plasmides codant les protéines delta p24 et p27. Dans une première étude, nous montrons que p27, et p24 dans une moindre mesure, inhibent la réplication du VHB, en bloquant l’activation des enhancers 1 et 2 responsables du haut niveau de réplication du VHB et de la spécificité hépatocytaire de cette réplication. De plus, nous montrons que p27 est capable d’activer le promoteur du gène codant la protéine antivirale MxA inductible par les interférons de type I (IFNa/b) et de potentialiser l’effet des IFNa/b sur ce promoteur MxA. Dans une seconde étude, nous avons recherché des mécanismes de pathogenèse spécifique liés au VHD, responsables de l’aggravation de la maladie hépatique au cours de l’infection VHB/VHD. L’activation des voies du stress oxydant semble être un mécanisme électif dans la pathogénicité des virus des hépatites B et C (VHC). En effet, les protéines non structurales, NS5A notamment, et la capside du VHC, ainsi que la protéine HBx et les protéines d’enveloppe du VHB, sont capables d’induire un stress oxydant au sein de la cellule. De nombreux facteurs de transcription impliqués dans diverses voies de signalisation cellulaire sont ainsi activés. Parmi ceux-ci, on distingue STAT-3, considéré comme un véritable oncogène, et NF-kB, deux facteurs clefs de la régulation de la prolifération et de la mort cellulaire, dont l’activation a été retrouvée dans de nombreux types de cancers dont l’hépatocarcinome cellulaire. Nos résultats montrent que p27 induit de façon significative un stress du RE, ainsi qu’une augmentation de la synthèse de l’enzyme NADPH oxydase 4 (Nox4), impliqués dans la production en excès de radicaux oxygénés (ROS) dans la cellule et la phosphorylation sur sérine ou thréonine de nombreux facteurs de transcription. Nous montrons en effet dans notre modèle, une production de ROS significativement plus élevée dans les cellules exprimant p27, de même que la phosphorylation et la translocation nucléaire de STAT-3 et de NF-kB. Ces résultats sont confirmés par l’utilisation d’antioxydants et d’inhibiteurs calciques qui inhibent cette activation. De même, en utilisant un plasmide p27 où la C211 est mutée en Sérine, nous avons obtenu une diminution de 50% de l’activation de STAT-3 et de NF-kB confirmant le rôle de l’isoprénylation dans les effets observés. Ainsi, en conclusion, nos résultats constituent une première approche de la compréhension des mécanismes de la pathogenèse hépatique spécifique liée au VHD.

  • Titre traduit

    Hepatitis delta virus : involvement of oxidative stress, STAT-3 and NF-kappaB in viral pathogenesis


  • Résumé

    The hepatitis delta virus (HDV) is a satellite of hepatitis B virus (HBV). HDV uses the HBV envelope proteins to form its viral particles. The HDV genome encodes two proteins, p24 (or small protein sHDAg) and p27 (or large protein LHDAg) from a single open reading frame located on the antigenome through an editing event occuring on the delta mRNA. P24 and p27 are identical, except for the 19 additional amino acids at p27 Cterminus, which contain an isoprenylation site on a cysteine residue at position 211 (C211). This isoprenylation is critical for addressing the delta ribonucleoprotein to the endoplasmic reticulum (ER) membrane, for interaction with HBV envelope proteins, assembly and secretion of delta virions. During HBV/HDV co-infection, an inhibition of HBV replication is generally observed. However, the resulting liver disease is much more severe, with a higher incidence of fulminant hepatitis, and an accelerated progression to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The mechanisms are unclear, but suggest a specific HDV-related pathogenesis. To explore these questions, we used a transient transfection of Huh7 hepatocytes, using plasmids encoding the p24 and p27 delta proteins. In a first study, we show that p27, and p24 to a lesser extent, inhibit HBV replication by blocking the activation of enhancers 1 and 2, reponsible for the high level of HBV replication. Moreover, p27 can activate the interferon type I (IFNa/b)-inducible MxA promoter, and potentiate the effect of IFNa/b on MxA promoter. In a second study we investigated possible specific pathogenic mechanisms relaed to HDV. The activation of oxidative stress pathways appears to be an elective mechanism in hepatitis B and C (HCV) pathogenesis. Indeed HCV nonstructural NS5A and core proteins, and HBV HBx and envelope proteins, can induce oxidative stress within infected cells. Many transcription factors involved in various cellular signaling pathways are thus activated. Among these, STAT-3, considered as a true oncogene and NF-kB are two key factors regulating proliferation and cell death. Their activation has been found in many types of cancer, including hepatocellular carcinoma. Our results show that p27 induces a significant ER stress and an increased synthesis of the NADPH oxidase 4 (Nox4) enzyme, involved in the overproduction of reactive oxygen species (ROS) in the cell, and serine or threonine phosphorylation of many transcription factors. Indeed, in our model, ROS production is significantly higher in cells expressing p27, as well as phosphorylation and nuclear translocation of STAT-3 and NF-kB. These results are confirmed by the use of antioxidants and calcium inhibitors that strongly inhibit this activation. Similarly, using a p27 plasmid construct in which C211 is mutated to serine, we obtained a 50% decrease of STAT-3 and NF-kB activation, confirming the role of isoprenylation in the observed effects. In conclusion, our results constitute a first approach to understanding the mechanisms of HDV-related liver pathogenesis.

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  • Détails : 1 vol. (261 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 237-261

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