Etudes structure-fonction du récepteur de l'apéline par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée : recherche d'agonistes et/ou d'antagonistes de ce récepteur

par Romain Gerbier

Thèse de doctorat en Pharmacologie

Sous la direction de Xavier Iturrioz et de Catherine Llorens-Cortes.

Soutenue en 2011

à Paris 5 .


  • Résumé

    L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ, un récepteur à sept domaines transmembranaires, couplé aux protéines G (RCPG). L’apéline et son récepteur jouent un rôle important dans le maintien de l’équilibre hydrique et dans la régulation des fonctions cardiovasculaires et métaboliques. Afin de développer des agonistes ou des antagonistes de ce récepteur, inexistants lorsque j’ai commencé mes travaux de thèse, il est important d���avoir des informations sur l’organisation structurale et fonctionnelle du récepteur ainsi que de son ligand, afin de comprendre comment l’apéline interagit avec celui-ci et comment elle l’active. Pour cela, nous avons construit en collaboration avec le Dr B. Maigret, le premier modèle tridimensionnel (3D) du récepteur de l'apéline complexé avec pE13F et K17F, par homologie avec le modèle validé du récepteur de la cholécystokinine de type 1. Le modèle obtenu a permis de visualiser plusieurs interactions entre l’apéline et son récepteur. Parmi celles-ci, deux arginines de l’apéline interagissent en surface du récepteur avec des résidus acides. La phénylalanine C-terminale de l'apéline, nécessaire à l’internalisation du récepteur de l'apéline et à l’effet hypotenseur de l’apéline, s’insère dans une poche aromatique composée des résidus aromatiques Trp 152 et Trp 259 et Phe 255, située au fond du site de liaison du récepteur. Nous avons vérifié ces interactions par des études structure-fonction par mutagenèse dirigée sur le récepteur de l'apéline. Nous avons ainsi montré que la Phe 255 et le Trp 259 interagissent avec la phénylalanine C-terminale de l’apéline et qu’ils jouent un rôle clé dans l'internalisation du récepteur de l'apéline, sans jouer de rôle dans la liaison de l’apéline à son récepteur, ni dans le couplage du récepteur à la protéine Gi. Cette étude représente une première validation du modèle 3D du récepteur de l’apéline. Nous nous sommes ensuite intéressés aux résidus du récepteur de l'apéline impliqués dans la liaison de l’apéline à son récepteur. Suite à la publication récente des structures cristallographiques de RCPG, nous avons construit avec le Dr B. Maigret, deux nouveaux modèles 3D du récepteur de l’apéline sur la base des structures cristallographiques des récepteurs b2-adrénergique et CXCR4. Dans ces trois modèles, nous avons observé une superposition parfaite de la poche aromatique décrite ci-dessus alors que de grandes différences sont apparues dans la nature des résidus interagissant avec l'apéline à la surface du récepteur. Par mutagenèse dirigée, nous avons montré que l’Asp92, le Glu172 et l’Asp282 sont des résidus essentiels à la liaison de l’apéline à son récepteur. Ceci nous a permis d'apporter une seconde validation du modèle 3D du récepteur de l'apéline et de sélectionner celui fondé sur la structure du CXCR4. Ce modèle pourra être utilisé pour réaliser des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles ainsi que pour développer un pharmacophore d’agoniste ou d’antagoniste du récepteur de l’apéline.

  • Titre traduit

    Structure-function studies by molecular modelisation and site-directed mutagenesis : identification of agonists or antagonists of this receptor


  • Résumé

    Apelin is the endogenous ligand of the receptor APJ, a seven-transmembrane domain receptor coupled to G-protein. Apelin and its receptor play an important role in the regulation of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. In order to design agonists or antagonists for the apelin receptor, nonexistent at the beginning of my thesis, it was important to define the structural elements in apelin and its receptor, required for apelin binding and subsequent receptor activation. To this end, we built, in collaboration with Dr. B. Maigret, the first three-dimensional (3D) model of the human apelin receptor complexed with pE13F or K17F, using a validated model of the cholecystokinin receptor-1 as a template. This model has shown different interactions between the apelin and its receptor. Among them, two arginines of the peptide interact with acidic residues at the top of the receptor. In addition, the C-terminal Phe of apelin, crucial for the internalization of the receptor and for the hypotensive effect of the apelin, is embedded in a hydrophobic pocket constituted by Trp 152, Phe 255 and Trp 259 and located at the bottom of the receptor. The reality of these interactions was evaluated by structure-function studies by site-directed mutagenesis on the apelin receptor. We then demonstrated that Phe 255 and Trp 259, by interacting with the C-terminal Phe of the peptide, are crucial for apelin receptor internalization without playing a role in apelin binding nor in the Gai coupling. This study represents the first validation of the apelin receptor 3D model. In order to pursue this validation, we focused our interest on the receptor surface to identify the residues involved in the apelin binding. For this purpose, two additional 3D models based on the b2-adrenergic and CXCR4 crystallographic structures recently published were built. The comparison of the three models showed a perfect superimposition of the hydrophobic pocket whereas the organization and the nature of the acidic residues implicated in the apelin binding are very different. In order to validate definitively one of these 3D models, we evaluated the role of these residues in the apelin binding by site-directed-mutagenesis. This study resulted in the identification of three key residues: Asp 92, Glu172 and Asp 282. These results validated the 3D model based on the CXCR4 crystallographic structure. This validated model will be used to perform in silico screening of virtual chemical libraries and may lead to the identification of agonists or antagonists of the apelin receptor.

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Informations

  • Détails : 1 vol. ( f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 116-135

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPHA 11653
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