Synthèse de nouvelles sondes de fluorescence bicolores pour le marquage des acides nucléiques et l'étude des interactions protéines-acides nucléiques

par Dmytro Dziuba

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Alain Burger et de Rachid Benhida.


  • Résumé

    La spectroscopie de fluorescence est un outil extrêmement sensible pour étudier les interactions acides nucléiques / ligands et leur dynamique. C’est pourquoi, à ce jour de nombreux analogues nucléosidiques présentant des propriétés de fluorescence ont été conçus, synthétisés et utilisés pour réaliser ces études. Néanmoins, des inconvénients persistent, ce qui limite le domaine d’application de ces sondes. Les 3-hydroxychromones (3HC) sont des sondes de fluorescence sensibles et possèdent des propriétés remarquables qui ont été exploitées principalement pour l’étude des protéines et des membranes. Cependant, aucune étude n’a été reportée dans la littérature pour des applications avec des acides nucléiques. Dans ce cadre, et en collaboration avec l’équipe du Professeur Y. Mély à Strasbourg, l’objectif de ce travail de thèse a concerné (i) la synthèse d’analogues de nucléosides contenant un motif 2-aryl-3HC, (ii) l’incorporation dans des séquences d’oligonucléotides (ODNs) et (iii) l’étude des propriétés biophysiques et photophysiques de ces ODNs marqués par la 3HC. Au cours de ce travail, nous avons développé plusieurs stratégies de synthèse pour accéder à deux familles de nucléosides fluorescents en introduisant (i) une modification complète de la base (2-thienyl-3HC-c-nucléoside) ou (ii) une modification partielle d’une base naturelle. Une de ces sondes a ensuite été incorporée avec succès dans des séquences d’ODNs, par un choix judicieux du groupement protecteur du groupement OH de la 3HC, puis étudiées pour leurs propriétés photophysiques dans un contexte simple brin, duplex (avec les différentes combinaisons de paires de bases) et en présence d’une protéine partenaire (NCp7). Ces études nous ont permis de dégager les conclusions suivantes : (i) la 3HC maintient remarquablement ces propriétés de sonde ratiométrique une fois incorporée dans des ODNs, aussi bien dans un simple brin que dans un duplex, (ii) la 3HC se comporte comme une base universelle (la 3HC reconnaît aussi bien un site abasique qu’une base nucléique) sans perturber la structure de la double hélice (DC), (iii) une grande photostabilité de la sonde et une forte sensibilité (déplacement des bandes N* et T* et des rapports d’intensités N* / T*) qui permet de distinguer parfaitement un état libre, simple brin ou duplex, (iv) finalement, les résultats très prometteurs obtenus en présence de l a protéine virale du VIH (NCp7à) ouvre la voie vers plusieurs applications potentielles.

  • Titre traduit

    Synthesis of novel two-color fluorescent probes for nucleic acid labelings and for nucleic acids - proteins interactions studying


  • Résumé

    Fluorescence sensing found broad application in nucleic acids structure, dynamic and protein interaction investigations. For this reason, numerous natural and synthetic fluorescent nucleoside analogs are applied for these studies ; nevertheless, the disadvantages inherited by the vast majority of them stimulate the research of new probes with optimized photophysical properties. 3-hydroxychromones (3HCs) are environment-sensitive fluorophores possessing remarkable photophysical properties. 3 HCs were sufficiently applied to study proteins and lipid membranes. However, no examples have been reported in the literature of 3HCs applied to nucleic acid labelling and sensing. In this context, in collaboration with the team of Pr. Y. Mély (Strasbourg University), the objectives of the thesis were the following : (i) the synthesis of the fluorescent nucleoside analogs containing 2-aryl-3HC structural moiety ; (ii) the incorporation of the fluorescent nucleosides in ODNs ; (iii) the study of biophysical and photophysical properties of 3HC-labeld oligonucleotides. During this research, different synthetic approaches were developed to access two kinds of fluorescent nucleosides : (i) nucleoside analogs with the nucleobase replaced by the 3HC moiety ; (ii) nucleobase analog with the natural base connected to the 3HC residue. By selecting an appropriate protecting group to mask the OH of 3HC, the fluorescent nucleoside of the first type was efficiently incorporated into ODNs. The photophysical properties of the 3HC incorporated into ODNs were investigated in single- and double—stranded forms, in different surrounding base context, and in the presence of the nucleic acid binding viral protein NCp7. The main information drawn from experimental results are the following : (i) the 3HC-contining nucleoside possesses the properties of a ratiometric fluorescent probe both in single- and double-stranded DNA ; (ii) the 3HC moiety possesses properties of an universal base, i. E. It does not perturb the structure of nuclei acid and can substitute any natural base or a base pair in DNA duplexes ; (iii) the improved photostability and high sensitivity of the dye to environmental changes in terms of normal (N*) and tautomer (T*) emission maxima and intensity ratio (N* / T*) changes allow to distinguish the free probe, single and double-stranded labelled DNA forms (iv) finally, promising results were obtained for 3HC mediated nucleic acid – protein interaction sensing in the experiments with the HIC-1 nucleocapsid protein NCp7 ; it makes the developed and new 3HC nucleoside fluorescent probe a prospective candidate for practical applications.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (204 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 191-204. Résumés en français et en anglais

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  • Bibliothèque : Université Côte d’Azur. Service commun de la documentation. Bibliothèque Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 11NICE4098
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