Etude fonctionnelle et évolutive de l'adressage des protéines dans le genre Plasmodium : le cas de la zinc-aminopeptidase de P. falciparum

par Cissé Sow

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Isabelle Florent.

Le président du jury était Pascale Debey.

Le jury était composé de Serge Bonnefoy.

Les rapporteurs étaient Catherine Braun-Breton, Denise Mattei.


  • Résumé

    Plasmodium falciparum est le parasite responsable du paludisme chez l’Homme. L’émergence de parasites résistants aux traitements a conduit au développement de nouveaux axes de recherches. Les protéases impliquées dans des métabolismes indispensables au parasite ont été retenues comme cibles potentielles de lutte contre Plasmodium. Parmi ces protéases, l’aminopeptidase PfA-M1 semble être un candidat intéressant depuis qu’il a été montré que les inhibiteurs spécifiques de cette enzyme sont capables de bloquer le développement du parasite. Codée par un gène en copie unique dans le génome de P. Falciparum, elle présente une activité optimale à pH 7,4 et pourrait avoir un rôle dans la dégradation de l’hémoglobine et/ou la ré-invasion des globules rouges. Cependant sa fonction précise dans le parasite reste à clarifier, de même que sa localisation dont les résultats publiés sont conflictuels. Durant mon travail de thèse, je me suis intéressée au processus de maturation de l’enzyme ainsi qu’à ses modalités d’adressage vers son compartiment final d’action, un projet qui s’inscrit dans la compréhension des mécanismes d’adaptation acquis par ce parasite au cours de l’évolution. Par immunofluorescence et en utilisant de nouveaux anticorps dirigés contre l’enzyme que j’ai développés, PfA-M1 a été localisée au niveau du cytoplasme du parasite dans des structures de type vésiculaires. Une étude par fractionnement biochimique a également montré que les trois formes solubles p120, p96 et p68 avaient des localisations subcellulaires différentes. La forme p120 a ainsi été retrouvée dans le parasite et la vacuole parasitophore, la forme p96, dans ce qui semble être des vésicules en formation dans la vacuole parasitophore et la forme p68, uniquement dans le parasite. Ces données suggèrent qu’après synthèse au niveau du réticulum endoplasmique, p120 est envoyée dans la vacuole parasitophore où elle est maturée en p96 puis retourne dans le parasite où elle est retrouvée sous sa forme p68. Pour valider ce modèle, j’ai étudié l’effet d’inhibiteurs bloquant l’endocytose (la méfloquine) ou le trafic vésiculaire (la chloroquine) de l’hémoglobine vers la vacuole digestive. J’ai ainsi montré que la chloroquine favorise la conversion en forme p96 alors que la méfloquine présente l’effet inverse. Ces deux molécules perturbent également l’adressage de PfA-M1 qui est retrouvée dans des vésicules plus marquées dans le parasite en présence de chloroquine et en bordure de parasite en présence de méfloquine. De manière importante ces vésicules sont distinctes de celles transportant l’hémoglobine vers la vacuole digestive. Afin d’étudier les signaux d’adressage de PfA-M1 sur des parasites vivants, j’ai également utilisé des plasmides permettant l’expression de divers domaines de PfA-M1 couplés à la GFP. Les protéines exprimées présentent des localisations différentes qui soutiennent l’idée que PfA-M1 emprunte bien la voie de sécrétion pour rejoindre son compartiment d’action. Ces résultats suggèrent aussi que les signaux d’adressage de l’enzyme sont complexes et probablement localisés dans ses extrémités Nterminale mais aussi C-terminale. L’étude de la conservation de ces signaux au sein du genre a été initiée par analyses bioinformatiques.


  • Résumé

    Plasmodium falciparum is the causative agent of human malaria. The increasing resistance of the malaria parasite to drugs has lead to the development of new trends. Proteases involved in essential metabolic pathways have been retained as potential targets to fight this parasite. Among these proteases, the aminopeptidase PfA-M1 seems to be a good candidate since it was shown that specific inhibitors of this enzyme can block parasite development. Encoded by a single copy gene in the P. Falciparum genome, PfA-M1 displays an optimal activity at pH 7. 4 and could play a role in haemoglobin degradation and/or red blood cells invasion. However its precise function in the parasite remains to be clarified, as recent studies on the localization of PfA-M1 have provided conflicting results. During this thesis, I focused my interest on the maturation process of PfA-M1 and on its traficking modalities to its final compartment of action. Such a project could provide a better understanding of the adaptative mechanisms acquired by this parasite during evolution. By immunofluorescence assays, using newly developed antibodies, PfA-M1 was localized in the cytoplasm of the parasite in vesicular structures. Biochemical analysis of three soluble forms of PfAM1 (p120, p96 and p68) resulted in evidence for their different subcellular localizations. The p120 form was found in the parasite and the parasitophorus vacuole, p96 was found in what seems to be vesicles in formation at the border of the parasite. The p68 form was found only in the parasite. These data suggest that after synthesis in the endoplasmic reticulum, p120 is sent to the parasitophorus vacuole and then processed into p96 form and finally returns to the parasite where it is found under the p68 form. To validate this model, we studied the effect of inhibitors disrupting haemoglobin uptake (mefloquine) or vesicular trafficking to the digestive vacuole (chloroquine). Our results showed that chloroquine favors the conversion of p120 into p96 while mefloquine causes an inverse effect. These two molecules also perturbe the targeting of PfA-M1 which localized in vesicles more intensively labelled in the parasite, in the presence of chloroquine and at the parasite's border, in the presence of mefloquine. Interestingly these vesicles are clearly distinct from those transporting haemoglobin to the digestive vacuole. To study the targeting signals of PfA-M1 by live imaging, we used plasmids allowing the expression of diverse domains of PfA-M1 genetically fused to the GFP. Expressed proteins present different locations which support the model that PfA-M1 uses the secretory pathway to reach its compartment of action. These results also suggest that the targeting signals of the enzyme are complex and probably localized in its N-terminal and C-terminal extremities. A theoretical study of the targeting signal conservation across the genus was undertaken by biocomputing analyses.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (183-16 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 149-178. Notes bibliogr

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  • Bibliothèque : Muséum national d'histoire naturelle. Bibliothèque centrale.
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  • Cote : TH 2011 -- 05
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