Transfert du CFTR par vecteurs de gènes dérivés des adénovirus ou par trogocytose de microparticules membranaires : mécanismes moléculaires et applications à la mucoviscidose

par Gaëlle Gonzalez

Thèse de doctorat en Virologie

Sous la direction de Saw-See Hong et de Pierre Boulanger.

Le président du jury était Gabriel Bellon.

Le jury était composé de Pascal Fender.

Les rapporteurs étaient Pierre Lehn, Marc Chanson.


  • Résumé

    La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR, conduisant à une altération de la fonction de canal à ions chlorure de la glycoprotéine transmembranaire CFTR associée à une atteinte pulmonaire sévère. Plusieurs études récentes ont amené à reconsidérer l’utilisation des vecteurs adénoviraux (Ad) de sérotype 5 (Ad5) dans la mucoviscidose, lesquels induisent non seulement des réactions immunes anti-adénovirales mais aussi des effets cytopathiques indésirables. (1) Dans une première partie de notre étude, nous avons étudié l’entrée et le transit intracellulaire de l’Ad5/F35, vecteur chimérique portant les fibres de l’Ad sérotype 35 sur une capside de sérotype 5. Nous avons montré que la protéine fibre est déterminante dans l’internalisation et le trafic intracellulaire de ce vecteur. Le vecteur Ad5/F35 exprimant la fusion GFP-CFTR s’est révélé (i) être dépourvu de cytotoxicité, (ii) transduire efficacement les cellules épithéliales pulmonaires par voie apicale, et (iii) restaurer l’activité de canal à chlorure dans les cellules CFTR(-). Il constitue donc un vecteur de transfert du gène CFTR potentiellement utilisable en thérapie génique de la mucoviscidose. (2) Dans une seconde partie, nous avons exploré une stratégie alternative de transfert de la protéine CFTR par trogocytose. Nous avons fait l’hypothèse que le canal CFTR pouvait être véhiculé par des microvésicules ou microparticules membranaires (MP) émanant de la membrane cellulaire et libérées dans le milieu de culture. En utilisant un système d’expression stable de la protéine CFTR étiquetée par la protéine fluorescente GFP (GFP-CFTR) dans des cellules donneuses, nous avons pu démontrer que les MP sont capables de prendre en charge et délivrer la protéine GFP-CFTR à des cellules réceptrices, mais ce transfert n’est assuré que par une population réduite de MP (≤ 8 %), et la durée de vie du GFP-CFTR n’est que transitoire (≤ 24h). En fait, la majorité des MP transfèrent des molécules d’ARN messager ou polysomal GFP-CFTR. La protéine GFP-CFTR néosynthétisée à partir de ces ARNm est exprimée plus tardivement (> 48h) mais de façon prolongée (≥ 10 jours). La fonctionnalité du canal CFTR ainsi néosynthétisé est en cours d’évaluation. Les MP constituent donc un nouveau type de vecteurs de transfert non génique du CFTR qui pourraient être employés en thérapie de la mucoviscidose.

  • Titre traduit

    Transfer of CFTR by gene tranfer vectors derived from adenoviruses or by trogocytosis of membrane-derived microparticle : molecular mechanisms and applications in cystic fibrosis


  • Résumé

    The cystic fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations of the CFTR gene, resulting in the alteration of the Cl channel function carried by the transmembranal glycoprotein CFTR, and associated with severe pulmonary complications. Several recent studies led the medical and scientific community to reconsider the use of adenovirus serotype 5 (Ad5)-based vectors as CFTR gene transfer vectors in CF gene therapy. Not only immune response against the vector itself and the ansduced cells have been observed, but also Ad5-induced nondesired cytopathic effects. (1) In the first part of our study, we analyzed the cell entry and traficking of Ad5/F35, a chimeric vector consisting of serotype 5 capsid carrying serotype 35 fibers. We showed that the fibre protein is the major, if not only, determinant of the internalisation and entry pathway of Ad5/F35. Ad5/F35-GFP-CFTR, expressing the fusin protein GF-CFTR, was found (i) to be devoid of detectable cytopathic effect, (ii) efficiently transduced airway epithélial cells via the apical pole, and (iii) restore the Cl channel function in CF cells. Ad5/F35 therefore represents a CFTR gene transfer vector with a great potential for gene therapy of CF. (2) In the second part of our study, we have investigated an alternative strategy based on the transfer of the mature CFTR protein via trogocytosis. We hypothesized that microvesicles or microparticules (MP) issued from the cell membranes and released into the culture medium could transport and achieve the cell-to-cell transfer of CFTR channel cargo. We engineered donor cells for stable expression of GFP-tagged CFTR protein (GFP-CFTR), and showed that donor cell-issued MP were capable of delivering GFP-CFTR protein to recipient cell. However, the GFP-CFTR protein was only transferred by a limited population of MP (≤ 8 %), and was only transient (≤ 24h). In fact, the major population of MP transferred mRNAGFP-CFTR or polysomal thereof. Interestingly, the GFPCFTR protein newly synthesized from this mRNAGFP-CFTR was expressed at late times after transfer (≥ 48 h) but in a prolonged manner (≥ 10 jours). The Cl canal function after MP-mediated CFTR transfer is being evaluated. MP represent a novel type of CFTR vectors which can be produced by specifically designed autologous donor cells, and which would overcome most of the inconveniences of gene therapy using viral or nonviral vectors.


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