Vecteurs lentiviraux et adénoviraux : développement de deux approches complémentaires pour le transfert de gènes dans des sous-populations spécifiques du système nerveux central

par Katia Lecolle

Thèse de doctorat en Neurosciences

Sous la direction de Morvane Colin.

Soutenue le 07-10-2011

à Lille 2 , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé (Lille) .


  • Résumé

    La dégénérescence neurofibrillaire (DNF) résulte de l’agrégation intraneuronale de matériel fibrillaire insoluble constitué de protéines Tau. Cette lésion est caractéristique d’un groupe hétérogène de maladies neurodégéneratives nommées Tauopathies, et dont certaines présentent une progression spatio-temporelle de la DNF, affectant de manière hiérarchisée et stéréotypée plusieurs populations neuronales reliées par des connexions neuroanatomiques. Actuellement, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à cette progression spatio-temporelle des lésions ne sont pas encore élucidés, en partie par le manque de modèles d’études adaptés. Mes travaux de thèse ont donc consisté à développer des outils capables de délivrer spécifiquement et efficacement des gènes dans une sous-population neuronale précocement touchée par la DNF – les neurones pyramidaux de la CA1 – dans le but final d’initier une pathologie Tau progressive et d’analyser les mécanismes sous-jacents à son évolution spatio-temporelle dans un modèle de rat. Différentes approches existent afin de transférer un gène dans une cellule, et la technologie virale reste encore aujourd’hui la plus efficace. De plus, il est désormais possible de modifier les propriétés des vecteurs viraux afin de leur faire acquérir une spécificité de ciblage cellulaire. Ces nouvelles compétences, associées à la possibilité de délivrer localement ces vecteurs dans le SNC via la stéréotaxie, nous ont amené à développer deux approches complémentaires, à l’aide de vecteurs lentiviraux pseudotypés ou de vecteurs adénoviraux modifiés.Les vecteurs lentiviraux (LV) pseudotypés avec l’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire, connus pour infecter efficacement les neurones dans des modèles murins, ont été injectés localement dans la couche de neurones pyramidaux de la CA1 de rats afin de médier l’expression d’une isoforme 4R de Tau. Qu’elles soient sauvages ou mutées en P301L, la surexpression des protéines Tau a permis d’initier un processus dégénératif progressif dans ces neurones, caractérisé par l’apparition de lésions histopathologiques caractéristiques et éventuellement d’un déficit mnésique. L’évolution de cette neurodégénérescence est plus lente avec la forme sauvage de protéine Tau, de manière cohérente avec la phase prodromale excessivement longue observée dans les Tauopathies sporadiques. De manière intéressante, une évolution spatiale des lésions histopathologiques est observée au cours du temps, en particulier avec l’isoforme sauvage de protéine Tau, celles-ci se propageant à des zones cérébrales éloignées mais anatomiquement reliées à l’hippocampe.Le vecteur adénoviral modifié HAdV-5-SRIF, ciblant une protéine membranaire fortement exprimée au niveau du compartiment somatodendritique des neurones pyramidaux de la couche CA1 – le récepteur à la somatostatine de type 2 (sstr2) –, nous a permis de démontrer qu’il était possible de pallier le manque de ciblage des neurones avec les vecteurs adénoviraux. En effet, les vecteurs adénoviraux parentaux utilisés dans la majorité des études précédentes ont donné des résultats décevants du fait notamment de l’hétérogénéité de l’expression du récepteur primaire aux adénovirus – le hCAR – au niveau cérébral. Notre vecteur, contenant la séquence de reconnaissance du sstr2 dans une des protéines d’attachement membranaire (la fibre adénovirale), est capable d’induire l’expression d’un gène rapporteur in vitro et dans une culture primaire de neurones, et ce avec une haute spécificité malgré les faibles doses virales utilisées. Les résultats préliminaires suite à son injection intrahippocampique dans un modèle de rat nous indiquent que celui-ci est capable de délivrer des gènes dans les neurones pyramidaux de la CA1

  • Titre traduit

    Lentiviral and Adenoviral vectors : development of two complementary approaches to gene transfer in specific sub-population of central nervous system


  • Résumé

    Engineering tools to specifically deliver genes in a restricted cell subpopulation in the central nervous system (CNS) is of great importance and is now the subject of active research. Such tools can be used for various applications, and the modelization of neurodegenerative diseases in a mouse model was discussed in this study.Neurofibrillary degeneration (NFD) result of the intraneuronal aggregation of insoluble fibrillar material composed of Tau proteins. This lesion is characteristic of a heterogeneous group of neurodegenerative diseases called tauopathies, some of which present a spatial and temporal progression of the DNF, affecting several neuronal populations connected by neuroanatomical connections in a hierarchical and stereotypical manner. Currently, the molecular and cellular mechanisms underlying the spatial and temporal progression of the DNF are not yet understood, partly due to the lack of relevant study models. In this context, my thesis work was to develop tools that can specifically and efficiently deliver genes to a neuronal subpopulation early affected by the DNF – the CA1 pyramidal neurons – with the ultimate goal of initiating a progressive Tau pathology and analyzing the mechanisms underlying the spatial and temporal evolution in a rat model. Different approaches exist to transfer a gene into a cell but viral technology still remains the most effective. In addition, it is now possible to change the properties of viral vectors in order to acquire them with a specificity of cell targeting. These new abilities, combined with the capacity to deliver locally these vectors into the CNS via stereotaxic injection, led us to develop two complementary approaches using pseudotyped lentiviral vectors or modified adenoviral vectors.Vesicular stomatitis virus G-pseudotyped Lentiviral vectors (LV), known to efficiently infect neurons in murine models, were injected locally into the CA1 layer of the pyramidal neurons of rats to mediate the expression of 4R Tau isoform. Overexpression of both wild-type or P301L mutated Tau protein initiated a progressive degenerative process in these neurons, and was characterized by the appearance of histopathological features and/or a memory deficit. The evolution of this neurodegeneration is slower with the wild-type form of Tau protein, consistent with the long prodromal phase observed in sporadic Tauopathies. Interestingly, a spatial evolution of histological lesions was observed over time, especially with the wild-type isoform of Tau protein, which propagated in distant brain areas but anatomically connected to the hippocampus.The use of a modified adenoviral vector HAdV-5-SRIF, targeting a membrane protein highly expressed in the somatodendritic compartment of the CA1 pyramidal neurons - the somatostatin receptor type 2 (sstr2) – led us to demonstrate that targeting neurons with adenoviral vectors was a feasible approach. Indeed, the parental adenoviral vectors used in several previous studies have been disappointing mainly because of the heterogeneous expression of primary receptor - the hCAR - in the brain. Our vector, containing the sstr2 sequence of recognition in the adenoviral fiber, is capable to induce the expression of a reporter gene in vitro and in primary neurons, with high specificity despite low viral doses used. Preliminary results following intra-hippocampal injection of this vector in a rat model indicate that this modified adenoviral vector is capable of delivering genes in the CA1 pyramidal neurons.The local injection of viral vectors that display neuronal tropism allows us to deliver genes in a specific subpopulation of interest, to initiate slow and progressive neurodegenerative process in rat model, especially with the wild-type Tau protein isoform.

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