Adaptation de chimères intergénotypiques 1a/2a du virus de l'hépatite C et caractérisation d'un clone cellulaire d'hépatocyte présentant un corps intracytoplasmique

par Pierre-Yves Delavalle

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Czeslaw Wychowski.

Soutenue le 01-12-2011

à Lille 1 , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé (Lille) .


  • Résumé

    Le virus de l’hépatite C (HCV) est un problème majeur de santé publique. On estime en effet que près de 3% de la population mondiale est infectée par ce pathogène qui se caractérise entre autre par sa grande variabilité génotypique. Les différentes souches de HCV ont été classées parmi six génotypes majeurs, eux même subdivisés en de nombreux sous-types. Toutes les souches de HCV n’ont pas la même capacité, comme JFH1 (génotype 2a), à se propager efficacement en culture cellulaire ce qui limite l’analyse des particules virales.Pour pallier la difficulté d’étudier le HCV de génotype 1a, des chimères inter génotypiques présentant les caractéristiques structurales du HCV de génotype 1a mais possédant le pouvoir réplicatif exceptionnel de l’isolat JFH1 (génotype 2a) ont été produites. Celles ci ont été adaptées à la culture cellulaire et plusieurs mutations d’adaptation ont été identifiées. L’importance de la protéine NS5 dans la formation des particules virales infectieuses ayant été également prouvée, cela nous a conduit à générer d’autres chimères pour lesquelles les séquences codant la protéine NS5A de JFH1 étaient substituées par celles de la souche H77, nous rapprochant ainsi du HCV de génotype 1a. Cela nous a permis d’identifier d’autres mutations d’adaptation pour ces chimères, permettant ainsi d’améliorer leur infectiosité en culture cellulaire. Par ailleurs, nous avons caractérisé une structure inédite présente au sein d’un clone de cellules d’hépatocytes (Huh-7w7.3) qui avait été sélectionné au cours d’une étude pour analyser le passage cellule à cellule des particules virales. Cette structure que nous avons dénommé SB pour « spheroid body » présente un enroulement des kératines 8 et 18 (K8/K18) emprisonné dans une cage de vimentine. Cette structure pouvant être assimilée à des inclusions cytoplasmiques, nous avons cherché alors à mieux la caractériser. Au cours de la division cellulaire nous avons remarqué que cette structure se désassemble et se réassemble pour ne recréer qu’un seul SB par cellule. Toutes nos analyses ont démontré que le SB n’est pas assimilable aux corps de Mallory (MDB) qui représentent des agrégats dans les hépatocytes. Par ailleurs, aucune mutation n’a été identifiée dans la séquence primaire des protéines K8, K18 et vimentine provenant des cellules Huh-7 et Huh-7w7.3. Cependant l’expression d’une GFP-K18 dans ces dernières conduisait à l’enroulement des filaments de kératines, contrairement à ce qui était observé dans les cellules Huh-7. En conclusion, nous avons isolé un clone cellulaire présentant un corps intra cytoplasmique tout à fait inédit impliquant des facteurs cellulaires présents dans la cellule Huh-7w7.3 et non dans celle de Huh-7.

  • Titre traduit

    Adaptation of intergenotypic 1a/2a HCV chimera and characterization of an hepatocyte cellular clone with unusual intracytoplasmic body


  • Résumé

    Hepatitis C Virus is a major public health problem, around 3% of the world population is estimated to be infected by this pathogen which is characterized by a great genotypic variability. The HCV strains have been classified within six major genotypes, subdivided in numerous subtypes. However all HCV genotypes are not able to spread efficiently in cell culture as JFH1 (HCV genotype 2a).In order to analyse the HCV viral particles of genotype 1a, inter genotypic chimeras having the structural characteristics of HCV genotype 1a but the replicative power of JFH 1 (genotype 2a) were produced. These chimeric viruses were adapted to the cell culture and several mutations have been identified. Furthermore, the NS5A protein has been described to be important for infectious viral particle formation. This lead us to generate chimeric viruses where the sequence coding for JFH1 NS5A protein was replaced by the corresponding sequence of H77 strain. We identified a new group of mutations in the adapted viruses, allowing to increase their infectivity in cell culture. Furthermore, a cellular clone containing an intracytoplasmic body was isolated from hepatocyte cell culture (Huh-7w7.3). This structure was named SB for “spheroid body”, and the keratins 8 and 18 (K8/K18), which formed the central core of the SB were surrounded by a vimentin cage-like structure. We examined whether this body could be related to some intracytoplasmic inclusions. During cytokinesis, the SB was disassembled and reassembled in a way to reconstitute a unique SB in each progeny cell. All our analyses indicate the SB is not related to Mallory Denk body, a well characterized intracytoplasmic inclusion. Moreover, the structure of SB was not due to mutations in the primary sequence of K8/K18 and vimentin. However GFP K18 expression leads to typical cytoplasmic whorls of intermediate filaments only in Huh-7w7.3 cells. In the present study, we have isolated a cellular hepatocytic clone containing an unusual cytoplasmic keratin-rich spheroid body involving cellular factors in the process of spheroid body formation.


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