Etude du rôle des canaux TRPC6 et de l'antidépresseur hyperforine dans l'homéostasie du zinc dans les neurones corticaux de souris

par Julien Gibon

Thèse de doctorat en Médecine

Sous la direction de Alexandre Bouron.

Soutenue le 28-09-2011

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (équipe de recherche) .

Le président du jury était Marc Savasta.

Le jury était composé de Alexandre Bouron, Muriel Bost, Alain Buisson, Etienne Lantreibecq, Bruno Chauffert.

Les rapporteurs étaient Peter Faller, Bruno Constantin, Bengt Jonsson.


  • Résumé

    Les canaux TRPC6 sont des canaux cationiques non sélectifs perméables au calcium et au sodium. In vitro, ils laissent passer du manganèse, du baryum ou du fer. Ces canaux peuvent être activés par des analogues du diacylglycérol (SAG ou OAG) et par l'hyperforine (un antidépresseur d'origine végétal). Des expériences de dosages par ICP-OES, d'imagerie synchrotron et d'imagerie de fluorescence du FluoZin-3 ont montré que les cellules HEK surexprimant TRPC6 sont enrichies en zinc. Ces cellules sont plus sensibles à un stress oxydant et produisent plus d'espèces réactives de l'oxygène que les cellules HEK non transfectées. Dans les cellules HEK exprimant TRPC6, l'entrée de zinc en réponse au SAG est plus importante que celle observée dans les cellules HEK ou HEK-TRPC3. Les canaux TRPC6 sont exprimés dans les neurones corticaux. En réalisant des expériences d'imagerie de fluorescence et d'électrophysiologie, nous avons observé que l'activation de ces canaux par le SAG ou par l'hyperforine permettait l'entrée de zinc dans les neurones. La taille du pool de zinc fixé sur des protéines à groupement thiols est augmentée après un influx de zinc via TRPC6. Ceux-ci forment donc une voie d'entrée pour ce métal dans les neurones corticaux embryonnaires. Dans certains types cellulaires, les canaux TRPC6 participent à l'entrée calcique déclenchée en réponse à la déplétion du stock calcique du réticulum (canaux SOC). Cependant, dans les neurones corticaux, les voies SOC et activées par l'hyperforine possèdent des propriétés pharmacologiques distinctes suggérant que les canaux TRPC6 ne participent pas à la voie SOC. L'homéostasie des métaux dans les neurones est perturbée par l'hyperforine. Cet antidépresseur diminue la taille des pools de calcium et de zinc des mitochondries à la fois lors de traitements aigus et chroniques. Une relocalisation du zinc est observée dans les neurones traités de façon chronique à l'hyperforine ainsi qu'une augmentation de l'expression des métallothionéines à la fois in vitro et in vivo. Chez la souris, la quantité de soufre du cerveau est augmentée lors un traitement à l'hyperforine. Celle-ci serait donc un antidépresseur qui module les capacités de stockage du zinc en augmentant le nombre de groupements thiols cellulaires. L'hyperforine est présente dans les extraits de millepertuis. Ceux-ci ont diverses cibles pharmacologiques, agissant notamment sur la voie de signalisation du BDNF. Nos expériences montrent que, lors d'un traitement chronique de souris adultes, l'hyperforine augmente l'expression de TrkB et P-TrkB dans le cortex. In vitro, dans les neurones corticaux, TrkB, CREB et P-CREB sont surexprimés après un traitement de trois jours à l'hyperforine. L'inhibition de la PKA ou le blocage des canaux TRPC6 par le SKF-96365 empêche l'effet de l'hyperforine. Par ailleurs, la chélation du calcium par le BAPTA-AM supprime partiellement l'effet de l'hyperforine. Un traitement chronique avec cet extrait végétal semble agir sur une voie dépendante de la PKA et du calcium pour réguler la phosphorylation de CREB et l'expression de TrkB. Nos expériences montrent que l'effet de l'hyperforine sur les acteurs de la voie du BDNF n'est pas présent au niveau de l'hippocampe où l'expression de TrkB n'est pas affectée. De plus, ces traitements n'influencent pas la neurogenèse adulte chez la souris. L'hyperforine seule n'explique donc pas les effets complexes des extraits de millepertuis sur les activités neuronales.

  • Titre traduit

    Roles of TRPC6 channels and hyperforin in the homeostasis of zinc in cortical neurons of mice.


  • Résumé

    TRPC6 channels are non selective plasma membrane cation channels permeable to calcium and sodium. In addition, in vitro data showed that they can transport manganese, barium or iron. These channels can be activated by diacylglycerol (DAG) or DAG analogues like SAG or OAG. They are also sensitive to hyperforin (a plant extract exhibiting antidepressant properties). ICP-OES experiments, X-ray synchrotron imaging and live-cell FluoZin-3 imaging show that the over expression of TRPC6 in HEK cells increases their zinc and sulfur content. This enrichment is associated with an increased sensitivity of transfected cells to oxidative stress by enhancing the production of reactive oxygen species in response to oxidative insults. The entry of zinc permitted by SAG or hyperforin is more pronounced in cells over-expressing TRPC6 when compared to HEK or HEK-TRPC3 cells. TRPC6 channels are expressed in cortical neurons. Electrophysiological recordings and experiments with the fluorescent zinc probe FluoZin-3 demonstrated that TRPC6 channels are permeable to zinc in neurons. The size of the 2-2 'dithiodipyridine (DTDP) sensitive pool of zinc is augmented after the entry of this metal through TRPC6. These channels form a zinc entry pathway in cortical neurons. In some cell types, TRPC6 are involved in the mechanism of calcium entry in response to the depletion of intracellular pools of calcium. This calcium entry occurs via store-operated Ca channels (SOC). In our experiments, we have shown that in cortical neurons, hyperforin-sensitive channels and SOC are distinct since they exhibit distinct pharmacological properties. Hyperforin influences the homeostasis of metals in cortical neurons. We found that acute or chronic applications of this antidepressant decreases the size of the mitochondrial pools of calcium and zinc. In addition, in vitro and in vivo data show that a chronic treatment causes a cellular redistribution of zinc, associated with an increased expression of metallothioneins. Furthermore, brains of mice are enriched in sulfur. It seems that this antidepressant influences the zinc storage capacities of brain cells by altering the cellular expression of thiol-containing molecules. Hyperforin is an extract of the medicinal plant St John Worth. This latter one possesses complex properties, acting notably on the BDNF pathway. A chronic treatment with hyperforin increases the expression of TrkB and P-TrkB in the cortex of mice. In cortical neurons, TrkB, CREB and P-CREB are up regulated by a chronic treatment with hyperforin. This process is sensitive to inhibitors of PKA, TRPC6 channels and to the chelator of calcium BAPTA-AM. On the other hand, a chronic treatment with hyperforin does not influence the BDNF pathway in the hippocampus and also does not modulate the adult neurogenesis. Thus, the brain effects of hyperforin are distinct from those induced by the whole St John Worth extract.


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