Identification of constitutively active forms of Arabidopsis MAP Kinases : brings more evidence on MPK4 function in plant immunity

par Souha Berriri

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Heribert Hirt.

Le président du jury était Bénédicte Sturbois.

Le jury était composé de Jean Colcombet, Martine Thomas.

Les rapporteurs étaient Sylvain Merlot, Thorsten Nürnberger.

  • Titre traduit

    Identification de mutants constitutivement actifs de MAP Kinases d’Arabidopsis : démonstration de leur intérêt à travers l’étude de la fonction de MPK4 dans les réponses aux pathogènes


  • Résumé

    La phosphorylation/déphosphorylation des protéines est un mécanisme de signalisation intracellulaire commun. Parmi les kinases végétales, les Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont impliquées dans de nombreux processus biologiques importants, comme la réponse aux stress biotiques et abiotiques, le développement et la dynamique du cytosquelette. Chez Arabidopsis thaliana et ce malgré de nombreux efforts, les fonctions des kinases impliquées dans les cascades MAPK restent peu inconnues. L'activation des kinases en utilisant des mutations mimant la phosphorylation des sites normalement phosphorylés est une approchequi a fait ses preuves dans le cas de MAP2Ks et a largement contribué à élucider leurs fonctions. Cette stratégie s’est révélée impossible dans le cas des MAPKs, puisque les résidus à muter restent encore à identifier. Pour contourner ce problème, nous avons adapté un crible basé sur la complémentation fonctionnelle d’un mutant MAPK de levure avec des formes aléatoirement mutées de MPK6d’Arabidopsis dans le but d'identifier des mutants présentant une activité constitutive. Nous en avons identifiés plusieurs et avons montré que ces formes constitutivement actives (CA) de MPK6 sont actives sans phosphorylation par les MAP2Ks. Par ailleurs, les mutations des résidus équivalents dans d'autres MAPKs les rendent également hyperactives, ce qui indique que cette stratégie peut être utilisée comme approche générale pour activer les MAPKs afin d’en comprendre les fonctions. L’étude des interactions protéine-protéine et l’analyse des profils dephosphorylation indiquent que les MAPKs CA conservent leur spécificité envers leurs substrats et interacteurs. Comme preuve de concept, nous avons généré des formes actives du MPK4. La MPK4 CA exprimée sous son propre promoteur a parfaitement complémenté le mutant mpk4. La caractérisation des lignées exprimant MPK4 CA confirme le rôle négatif de cette kinase dans les réponses de défense aux pathogènes des plantes que ce soit dans la PTI (PAMP Triggered Immunity) ou dans la ETI (Effector Triggered Immunity). Globalement, ce travail permettra de fournir des informations directes sur les cibles des MAPKs et devrait contribuer à la compréhension globale de la transduction du signal chez les plantes.


  • Résumé

    Protein phosphorylations and dephosphorylations are common events occurring duringintracellular signaling processes. Among plant kinases, Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) are involved in signaling of many important biological processes, including biotic and abiotic stresses, development and cytoskeleton organization. Despite an abundant literature on MAPKs, the exact roles and direct targets of many Arabidopsis thaliana MAPKs are not clear yet. The activation of kinases using phospho-mimicking mutations of the phosphorylated residues was a successful approach in the case of MAP2Ks, helping to elucidate their functions. This strategy failed in the case of MAPKs since the necessary residues to mutate remain unclear. To bypass this problem, we adapted a screen based on the functional complementation of a MAPK yeast mutant with randomly mutated Arabidopsis MPK6 in order to identify the ones mutants showing constitutive activity. We identified several clones and showed that these constitutively active (CA) of MPK6 candidates are indeed active without phosphorylation by MAP2Ks. Interestingly, mutations of the equivalent residues in other MAPKs triggered constitutive activity as well, indicating that this strategy may be used as a general approach to activate MAPKs and identify their functions. Interaction and phosphorylation assays indicatedthat CA MAPKs retain their substrate and interactor specificity. As proof-of-concept, we generated active versions of MPK4. CA MPK4 expressed under itsown promoter successfully complements mpk4 mutant plants. Characterization of CA MPK4 lines further confirmed the negative role of MPK4 in plant pathogen defense responses and its implication in both PTI (PAMP Triggered Immunity) and ETI (Effector Triggered Immunity). Overall, the work will help to provide direct information on all MAPK targets and should be an important contribution to the overall understanding of signal transduction in plants.

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