Modélisation de l'évolution dirigée de la tyrosyl-ARNt synthétase in silico. Introduction d'acides aminés non naturels dans les protéines

par Najette Amara

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Thomas Simonson.

Soutenue en 2011

à Palaiseau, Ecole polytechnique .


  • Résumé

    Les protéines sont synthétisées essentiellement à partir d'acides aminés L. Cependant, les acides aminés D sont naturellement présents dans notre organisme. Il existe plusieurs mécanismes de régulation pour limiter leur présence. Il peut y avoir un intérêt bio-technologique à introduire des acides aminés D dans les protéines pour leur conférer des fonctions chimiques nouvelles. Les protéases, chargées de dégrader les peptides, reconnaissent moins bien les protéines possédant de tels acides aminés. Dans notre cas, présenter la tyrosine sous son énantiomère D donnerait un avantage par rapport aux protéases. En effet, un peptide qui aurait des acides aminés D, resterait plus longtemps actif dans un organisme. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) a déjà été utilisée pour l'incorporation de plus d'une trentaine d'analogues de la tyrosine dans les protéines. Cette enzyme possède déjà une activité naturelle pour la D-tyr, mais celle ci est très faible. L'objectif du présent travail est de l'améliorer par une méthode d'évolution dirigée iin silico. Cette méthode consiste à muter aléatoirement une protéine puis à sélectionner les mutants qui ont les propriétés désirées, mimant les mécanismes de l'évolution naturelle. L'évolution dirigée textit{in silico} a déjà été utilisée pour l'ingénierie d'un grand nombre de protéines. On utilise pour cette étude le programme d'évolution dirigée développé au laboratoire qui procède à une optimisation itérative de la séquence et de la structure. Des mutations ont été retenues par cette méthode et proposées aux expérimentalistes du laboratoire de biochimie pour des validations expérimentales. Ils ont conclut que plusieurs mutants présentent une activité faible mais mesurable pour la D-Tyrosine. L'étude a été étendue à d'autres résidus proches de l'ammonium de la L-Tyr. Nous avons identifié d'autres positions qui pourraient être intéressantes à muter. L'étude, faite dans un premier temps avec le ligand tyrosine, a été ensuite améliorée en considérant le ligand Tyrosyl adénylate (tyrAMP). C'est l'intermédiaire qui va interagir avec l'ARNt pour former l'ARNt-Tyr. Le L-TyrAMP et le D-TyrAMP ont tous deux été modélisés avec la TyrRS d'Escherichia coli. Toutes ces modélisations ont conduit à une liste de séquences mutantes qui ont été prédites comme favorables à la liaison du D-TyrAMP. Chacune des séquences obtenues pour les deux synthétases a ensuite fait l'objet d'une étude plus approfondie visant à déterminer la spécificité pour le ligand D-TyrAMP. Suite à cela, nous avons sélectionné une dizaine de séquences de TyrRS mutantes d'Escherichia coli afin de réaliser des calculs de dynamique moléculaire. Nous avons utilisé les ressources du super calculateur du CINES (Centre Informatique Nationale de l'Education Supérieur) pour faire des études de dynamique moléculaire. Une meilleure estimation de l'affinité de ces différents mutants pour le D-TyrAMP a été atteinte. Un autre but de la thèse était d'améliorer notre protocole de Protein Design en adoptant un champ de force tout atome et un modèle de solvant plus sophistiqué. Pour le solvant, le modèle de Born généralisé que nous avons implémenté dans le protocole est basé sur la théorie de Poisson-Boltzmann, avec un continuum diélectrique qui entoure la protéine. Les validations sur des peptides tests ont été concluantes. L'évolution dirigée de la TyrRS de Bacillus Stearothermophilus sert de validation à ce protocole car des mesures expérimentales pour une quinzaine de mutants sont disponibles.

  • Titre traduit

    Protein evolution, refinement of a protein design method and application to a t-RNA aminoacyl synthetase


  • Résumé

    Although most proteins are usually synthesized with L-amino acids, D-amino acids are present in organisms in their free states, included in shorts peptides and even in particular proteins. Introducing D-amino acids in proteins in a controlled way can provide a biotechnological advantage, adding new function to proteins. Tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) has already been used to incorporate more than thirty tyrosine analogues in proteins. Using the D-enantiomer of the tyrosine can give resistance to proteases in cells. Because proteases recognizes less proteins with such amino-acids, peptides bearing those will stay active much longer. TyrRS has a natural though weak activity for D-Tyrosine. The purpose of this thesis is to improve this activity by an in silico directed evolution method. The method consists in randomly mutating a protein to select mutants with the desired properties, mimicking mechanism of natural evolution. We use for this study an in house program of directed evolution. It is based on an iterative optimization procedure of both protein sequence and structure. Some mutants have been predicted by this method and proposed to biochemists for experimental in vivo validations. They find that some mutants present a weak, but measurable, activity for the D-Tyrosine. The field of study has thus been enlarged to other mutation positions around the tyrosine ammonium group. We study TyrRS and its binding with either L or D tyrosine and furthermore consider an activated form of the aminoacid, the tyrosinyl-adenylate in both geometry L and D. This compound has been modeled with the E. Coli TyrRS to make molecular dynamic studies. We have use the large ressources of the CINES (Centre Informatique National de l'Education Supérieure) and our laboratory cluster to simulate a maximum of molecular dynamics on our predicted mutants. Another goal of this work was to improve our in house protein design methods with a more sophisticated solvent model. In order to do so, we used Born's model based on the Poisson-Boltzmann theory. Rather than describing solvent as individual molecules, this model considers it as an electrostatic continuum surrounding the protein. We validated that new protocol on samples presenting experimental data to compare with. We succesfully tested three small peptides before further simulationss were carried out in the same way on a Bacillus stearothermophilus TyrRS mutants set.

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  • Détails : 1 vol. (310 p.)
  • Annexes : Bibliographie : 270 réf.

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