Etude de l'évolution du potentiel génétique de populations bactériennes dégradant l'atrazine

par Frédérique Changey

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Fabrice Martin-Laurent et de Marion Devers-Lamrani.

Soutenue le 16-12-2011

à Dijon , dans le cadre de École doctorale E2S Environnements, Santé, STIC (Dijon) , en partenariat avec Centre de Microbiologie du Sol et de l’Environnement (Dijon) (laboratoire) .

Le président du jury était Jean Guzzo.

Le jury était composé de Yves Jouanneau, Stéphane Pesce.

Les rapporteurs étaient Isabelle Batisson, Pascal Simonet.


  • Résumé

    L’atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l’environnement. L’exposition chronique à cet herbicide a conduit à l’émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l’atrazine et de l’utiliser comme une source d’azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l’atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l’environnement. L’objectif de ce travail était d’étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l’amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d’identifier les processus adaptatifs impliqués dans l’évolution de la fonction de BDA de l’atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l’importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l’atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l’atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l’atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l’atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l’évolution de la capacité de dégradation en présence d’une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d’évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L’exposition à l’acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l’atrazine, a conduit à la sélection d’une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l’acide cyanurique comme source d’azote. Cette population est caractérisée par une délétion d’une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l’acide cyanurique restant inchangée. (ii) L’exposition à l’atrazine a conduit à la sélection d’une populationnouvellement évoluée caractérisée par l’insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d’évaluer, à l’échelle d’une communauté microbienne synthétique, l’évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l’atrazine est très versatile et qu’elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d’exposition des populations dégradantes au pesticide.


  • Résumé

    Atrazine, one of the most used herbicide to control the development of weeds in crop, has led to the contamination of the environment. Repeated exposure to this herbicide resulted in the emergence of microbial populations able to degrade atrazine and to use it as a nitrogen source for its growth. These microbial populations are responsible for accelerated biodegradation of atrazine (BDA), a key ecosystemic service diminishing the persistence of this herbicide in the environment. The aim of this PhD work was to study genetic and physiological mechanisms responsible for functioning and improving of this ecosystemic service. We applied an experimental approach starting from genes to communities degrading atrazine in order to identify processes of adaptation involved in the evolution of accelerated biodegradation function.The first part of the PhD aimed at evaluating the importance of accumulation of single mutations in the atzA gene for the activity of AtzA transforming atrazine to hydroxyatrazine. Sequencing or atzA genes amplified from different atrazine-degrading isolates (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps and differents Chelatobacter heintzii) showed that atzA sequence was conserved. However, four non synonymous mutations were identified (1 for Pseudomonas sp. ADP Ps and 3 for Chelatobacter heintzii). Modeling of AtzA structure showed that three mutations were located in important regions (active site, interaction with atrazine and with the metal Fe2+). [...] The second part aimed at studying the plasticity of the atrazine-degrading pathway in two opposed conditions: (i) one aiming at evaluating the persistence of degrading capability in absence of selection pressure and (ii) a second one aiming at evaluating the evolution of degrading capability under high selection pressure exerted by atrazine. With these aims, experimental evolutions were carried out with Pseudomonas sp. ADP. (i) We showed that cyanuric acid exposure led to the selection of a newly-evolved population characterized by increased growing ability on culture medium containing this substance as nitrogen source. This population is characterized by the deletion of a 47 kb region containing atzABC genes from ADP1. We showed that increased fitness of newly-evolved population was due to the selective loss of the genetic burden represented by the 47 kb region, the cyanuric acid degrading ability remaining unchanged. (ii) Atrazine exposure led to the selection of population characterized by the insertion of ADP1 plasmid in the bacterial chromosome. [...] The third part aimed at developing a tool allowing monitoring the evolution of atrazine-degrading genetic potential at the scale of a synthetic microbial community. To do so four degrading strains among which, one was isolated in this study, were chosen. [...] Altogether, these results showed that the atrazine accelerated biodegradation function is highly versatile and under constant evolution. Furthermore, they highlight that the exposure to atrazine is the key parameter driving the evolution of degrading population


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