La chromatographie en mode mixte pour la purification de protéines recombinantes à visée santé : caractérisation des interactions impliquées dans les supports de chromatographie HyperCel®, modélisation et applications.

par Jérôme Pezzini

Thèse de doctorat en Sciences, technologie, santé. Biochimie

Sous la direction de Xavier-François Santarelli.

Soutenue le 19-12-2011

à Bordeaux 2 , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) .

Le président du jury était Bernard Gallois.

Le jury était composé de René Gantier, Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.

Les rapporteurs étaient Philippe Cardot, Frédéric De Lamotte Guéry.


  • Résumé

    La chromatographie mode mixte représente l’une des plus grandes évolutions de ces dernières années dans le domaine des bioséparations. Cette technique repose sur l'intervention de plusieurs types d'interactions au sein d'un seul et même support. Les résines de chromatographie mode mixte HEA, PPA et MEP HyperCel portent des groupements aliphatiques, aromatiques, thiophiliques ainsi que des groupements aminés protonables en différentes positions. Au moyen d’expériences de chromatographie, à l’aide de protéines standards aux propriétés spécifiques et de mélanges complexes, nous avons isolé ces différentes interactions. Nous avons mis en évidence l’intervention majeure d'au moins deux types d'interactions au sein de ces supports : interactions hydrophobes et électrostatiques. Nous avons pu observer le comportement des résines lors de variations de pH, de force ionique, de types de sels et de tampons ou lors de la présence d'autres composés organiques. Nous avons mis en évidence l'intervention combinée de ces types d'interactions lors des différentes phases de chromatographie. Le comportement des résines mode mixte a révélé des sélectivités particulières et dont le contrôle ciblé à l'aide de l'environnement a permis le développement de méthodes de purification efficaces et originales. Nous avons pu ainsi développer des applications telles que la purification de fragment d’anticorps (Fab’2) à partir de culture de cellules d’insectes, la capture de protéine de type MBP à partir d’extrait bactériens et la capture d’anticorps monoclonaux à partir de cellules de mammifères (CHO), et ainsi améliorer les conditions d’utilisation de la chromatographie en mode mixte.

  • Titre traduit

    Mixed mode chromatography for recombinant protein purification : characterization of HyperCel® sorbents interactions, modeling and applications


  • Résumé

    Mixed mode chromatography is the most innovative technique for bioseparation. Mixed mode resins, as the term suggest, involves multiples types of interaction at the same time. HyperCel mixed mode resins, HEA, PPA and MEP, involve aliphatic, aromatic or thiophilic groups as well as protonable amine located in the spacer arm or as a head group. Using classical chromatographic experiments, standards proteins and complex mixtures, we highlighted the two major types of interactions involved: hydrophobic and electrostatic interactions. We specifically influenced these interactions by modifying the environment in terms of ionic strength, pH, salt types, and other compounds. The combination of these interactions during every phase of a chromatographic process has been demonstrated. Mixed mode resins thus offer unique selectivity that can be controlled by the environment. This allowed us to develop several applications from antibodies fragments capture from insect cells, to the purification of MBP-tagged proteins, through monoclonal antibody capture from CHO cells. We thus enhanced mixed mode chromatography.


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