Caractérisation du système AM/AMR dans les glioblastomes humains et étude d'un nouveau concept d'anticorps à visée thérapeutique

par Carine Tesic

Thèse de doctorat en Neurosciences

Sous la direction de L'Houcine Ouafik.

Le président du jury était L'houcine Ouafik.

Le jury était composé de L'Houcine Ouafik, Gilles Freiss, Pierrick Gandolfo, Kamel Mabrouk.

Les rapporteurs étaient Gilles Freiss, Pierrick Gandolfo.


  • Résumé

    Les glioblastomes sont des tumeurs fatales du fait de leur agressivité et du manque de traitements efficaces. La prolifération accrue, le caractère invasif et la résistance à la mort cellulaire du compartiment tumoral des glioblastomes leur confèrent une croissance rapide et une invasion du parenchyme cérébral environnant, à l’origine de leur systématique récidive. De plus, le processus d’angiogenèse au sein de ces tumeurs participe activement au mauvais pronostic en développant une forte vascularisation qui favorise leur croissance.Un peptide vasoactif l’Adrénomédulline (AM), est exprimé de façon ubiquitaire chez l’homme et a de ce fait un large champ d’action à travers l’organisme dont la progression tumorale en agissant de façon autocrine et paracrine via ses récepteurs CLR/RAMP2 et CLR/RAMP3 (« AMR »). Or l’expression de l’AM est corrélée avec le grade des gliomes. De plus, il a été démontré au sein de notre équipe que des anticorps polyclonaux anti-AM développés au laboratoire inhibent la prolifération des cellules gliales tumorales de glioblastomes in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Il a également été montré que des anticorps polyclonaux (anti-AMR) dirigés contre les récepteurs de l’AM (CLR, RAMP2 et RAMP3) inhibent in vitro la croissance, la migration et la formation en pseudo-capillaires des cellules endothéliales (HUVECs), suggérant une neutralisation par ces anticorps, de certaines étapes de l’angiogenèse. De même, il a été démontré dans des modèles in vivo que les anticorps anti-AMR inhibent la croissance tumorale en supprimant l’angiogenèse et la croissance des cellules tumorales, suggérant ainsi que les récepteurs de l’AM constitueraient une bonne cible thérapeutique. Ces études ayant été effectuées à partir de lignées cellulaires, nous avons caractérisé le système AM/AMR au sein des composantes gliales et microvasculaires provenant des cultures primaires de glioblastomes de patients puis nous avons testé l’effet de l’AM dans certains phénomènes caractéristiques des glioblastomes comme l’invasion et certaines étapes de l’angiogenèse tumorale. Il résulte de cette étude que l’AM est trois fois plus secrétée par la composante microvasculaire tumorale au sein de laquelle l’AM favorise la migration, l’invasion et l’organisation en pseudo-capillaires. De plus, l’AM favorise l’invasion des cellules de la composante gliale tumorale.Des anticorps capables de reconnaître et neutraliser à la fois l’AM, le CLR, RAMP2 et RAMP3 agissant de la même manière sur la croissance tumorale et l’angiogenèse représenteraient un bénéfice thérapeutique majeure. Le laboratoire a alors développé des anticorps dirigés contre un peptide chimérique constitué de l’enchainement de séquences peptidiques des protéines CLR, RAMP2, RAMP3 et du peptide AM (« AMRc »). Les tests effectués avec les anticorps anti-AMRc nous permettent d’affirmer leur efficacité sur le système AM/AMR. Le traitement par ces anticorps diminue la croissance in vitro et in vivo des cellules tumorales de glioblastomes U87, ainsi que leur migration et leur invasion et la densité vasculaire au sein de xénogreffes, ce qui suggère leur effet sur l’angiogenèse tumorale. De plus, le traitement par ces anticorps augmente la perméabilité du modèle de cellules endothéliale microvasculaires HMECs. Ces résultats très encourageants, nous permettent donc pour le moment de valider la faisabilité du concept d’anticorps développés à partir d’un peptide chimère pour neutraliser le sytème AM/AMR, dans le but d’envisager dans le futur une application thérapeutique.


  • Résumé

    Glioblastomas are fatal tumors because of their aggressiveness and the lack of effective treatments. The increased proliferation, invasiveness and resistance in cell death of glioblastomas tumoral compartment confer them a fast growth and an invasion of the surrounding cerebral parenchyma, at the origin of glioblastomas systematic recurrence. Furthermore, angiogenesis within these tumors participates actively in the poor prognosis developing a strong vascularization, which favors their growth.Adrenomedullin (AM), is a vasoactive peptide ubiquitously expressed in humans and thus induces multiple biological actions through the body as tumor growth, via autocrine and paracrine activation of its receptors CLR/RAMP2 and CLR/RAMP3 (« AMR »). But AM expression is correlated with gliomas grading and our team demonstrated that polyclonal antibodies « anti-AM » developped in the laboratory inhibited in vitro glioblastoma tumoral cells proliferation and in vivo tumor growth. Polyclonal antibodies (anti-AMR) directed against AM receptors (CLR, RAMP2 and RAMP3) also inhibited in vitro growth, migration and endothelial cells (HUVECs) pseudo-capillar formation, suggesting neutralization of some steps of angiogenesis. Moreover, anti-AMR antibodies inhibited in vivo tumor growth by suppression of angiogenesis, suggesting AM receptors as a therapeutical target.These studies have been done from lineage cells. We thus characterized AM/AMR system within glial and microvascular components from patients glioblastoma primary cultures and we investigated AM impact in some stages of angiogenesis. We showed that AM was three fold higher expressed by microvascular cells in whom AM induces migration, invasion and organization into a meshwork of capillary-like tubular structures. AM increased too, glial tumoral cells migration and invasion.Antibodies able to recognize and neutralize AM, CLR, RAMP2, RAMP3 and acting in tumor growth and angiogenesis would represent a major therapeutic benefit. Then, the laboratory developped polyclonal antibodies directed against one chimeric peptide synthesized with AM, CLR, RAMP2 and RAMP3 peptide sequences (named « AMRc »). The tests made with anti-AMRc antibodies allow us to assert their efficiency on the AM / AMR system. Glioblastoma cell line U87’s growth decreases in vitro and in vivo after treatment with anti-AMRc antibodies, as well as its migration, invasion and vascular density inside tumor xenografts, suggesting an impact in tumor angiogenesis. Furthermore, the treatment with these antibodies increases the microvascular endothelial HMECs permeability. These promising results allow us to validate the feasibility of a concept of antibodies developed against one peptide to neutralize AM/AMR system, in order to envisage a future therapeutic application.


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