Moyens modernes du diagnostic de la tuberculose pulmonaire

par Amel El Khechine

Thèse de doctorat en Pathologie humaine

Sous la direction de Michel Drancourt.

Le président du jury était Jean-Louis Mège.

Le jury était composé de Michel Drancourt, Jean-Louis Mège, Max Maurin, Christophe Sola.

Les rapporteurs étaient Max Maurin, Christophe Sola.


  • Résumé

    Les méthodes pour le diagnostic des infections à mycobactéries sont restées pratiquement inchangées pendant des décennies et n'auraient probablement pas progressé sans la réémergence inattendue de la tuberculose (TB) au cours des vingt dernières années du 20ème siècle. Le diagnostic de laboratoire de la tuberculose pulmonaire repose principalement sur la détection des organismes du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC) dans les prélèvements respiratoires par leur isolement et identification ou par les méthodes moléculaires. Pour les patients qui n’expectorent pas, des échantillons du tractus respiratoire peuvent être obtenus par des procédures invasives. En nous basant sur la survie connue de MTC dans le liquide gastrique, nous avons considéré que les MTC devraient également être détectables dans les selles. Nous avons recherché des MTC en parallèle dans des échantillons de tractus respiratoire et dans les selles récoltés des mêmes patients. Mycobacterium tuberculosis a été détecté après décontamination à la chlorhexidine dans des cultures sur des milieux à base d'œuf et par l'examen direct microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen. Après la mise au point d’une technique originale d’extraction de l’ADN total à partir des selles, nous avons utilisé la détection de M. tuberculosis par PCR en temps réel en duplex utilisant le gène IS6110 comme cible moléculaire et un contrôle interne de présence d’inhibiteurs de la PCR. Ces travaux mettent en évidence l’intérêt et la sensibilité de l’analyse des selles pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Cette technique est aujourd’hui utilisée dans notre laboratoire en routine et est en cours d’évaluation par d’autres équipes.Actuellement, l'identification des mycobactéries basée sur l’analyse des caractéristiques biochimiques (test à l’uréase, test de la nitrate réductase, test de la résistance à la pyrazinamide (pza), test de la sensibilité, test de la résistance à la thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) etc …) est le plus souvent remplacée par des méthodes de biologie moléculaire dont l’amplification par PCR d'un gène spécifique. Ces méthodes sont laborieuses et peuvent exiger un degré d'expertise élevé. Afin de simplifier l'identification précise des isolats de mycobactéries en laboratoire de routine, après avoir vérifié l’inactivation des MTC par la chaleur et l’éthanol pour pouvoir travailler hors du laboratoire P3, nous avons mis au point les conditions pour l'utilisation de la spectrométrie de masse « matrix-assisted laser desorption and ionisation-time-of-flight» (MALDI-TOF-MS) en association avec un logiciel bioinformatique spécifique, comme outil d’identification et de différenciation entre les membres du complexe MTC, du complexe Mycobacterium avium et les autres mycobactéries non-tuberculeuses. Nous avons ensuite appliqué cette technique afin d’identifier les mycobactéries à partir du milieu liquide Middlebrook 7H10 utilisé dans une étuve automatisée. L’identification des mycobactéries isolées dans notre laboratoire, est maintenant réalisée en routine par MALDI-TOF-MS. L’ensemble de ces travaux contribue à améliorer le diagnostic de routine de la tuberculose pulmonaire et les techniques mises au point sont utilisées en routine dans notre laboratoire, en particulier dans le cadre d’un « kit tuberculose ».


  • Résumé

    The diagnosis of mycobacterial infections remained practically unchanged during numerous decades and would not probably have progressed of the whole without the unexpected re-emergence of the tuberculosis (TB) during the last twenty years of the 20th century.The diagnosis of laboratory of pulmonary tuberculosis is mainly based on the detection of microorganisms of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) in the respiratory specimens. For the patients who do not expectorate, samples of the respiratory tract can be only obtained according to invasive procedures. Based on the survival known for MTC organisms in the gastric liquid, we considered that MTC organisms would be detectable also in samples of stools. We compared the presence of bodies MTC in samples of respiratory tract and the specimens of stools collected from the same patients. MTC was detected in cultures on egg-based media after appropriate decontamination using the chlorhexidine and by the microscopic examination after Ziehl-Neelsen staining. After the set on of an original protocol of the total DNA extraction from stools, we were able to use by the detection with the real-time PCR of IS6110 using internal controls as PCR inhibitor control. This protocol illustrate the utility of stool analysis for the diagnosis of pulmonary tuberculosis, this technique is actually used in routine in our laboratory, it is also under investigation by other research teams.Phenotypic identification of mycobacteria based on the analysis of biochemical pattern (urase test, nitrate reductase test, resistance to pyrazinamide (pza) test, susceptibility to thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) test, etc …) is more often replaced by molecular methods using DNA, including the development by PCR of a specific gene. These methods are generally laborious and can require a considerable degree of expertise. To simplify the identification specifies isolates of mycobacteria routinely in the laboratory, we estimated the use of the mass spectrometry "matrix-assisted laser desorption and ionization-time-of-flight" (MALDI-TOF MS) in association with a specific bioIT software, was capable of identifying and of distinguishing between the members of Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium avium complex and the non- tuberculosis mycobacteria. We verified the MTC inactivation by heating or by ethanol allowing the analysis of the inactivated MTC out of the P3 laboratory; we studied the cost-effectiveness of this method from the blood solid media by extrapolating this approach in the emergent countries. We then applied the same method to identify mycobacteria from Middlebrook 7H10 liquid media used in an automated oven. Identification of cultured Mycobacteria is now done in routine in our laboratory by MALDI-TOF-MS. These data contribute in improving the routine diagnosis of pulmonary tuberculosis and this protocol is then used routinely in our laboratory, particularly with the “kit de tuberculose” we set on.


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