Analyse fonctionnelle des différentes isoformes codées par le gène Dermokine

par Leïla Gazeilles

Thèse de doctorat en Gènes, cellules et développement

Sous la direction de Marina Weber Vivat.

Soutenue en 2010

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    La fonction de barrière de l'épiderme est assurée par sa partie la plus superficielle, la couche cornée constituée de cornéocytes, cellules très inter-cohésives, entourées d'un milieu extracellulaire riche en lipides. Les cornéocytes résultent de la cornification, une mort cellulaire programmée particulière. Les éléments constitutifs de ces cellules et de leur milieu sont donc principalement synthétisés par la couche vivante sous-jacente constituée de kératinocytes granuleux. De façon surprenante, un des transcrits les plus abondants de cette assise épidermique code pour une protéine de fonction inconnue, la dermokine (DMKN). DMKN subit un épissage alternatif complexe, aboutissant à la production de quatre types d'isoformes : delta, qui est intracellulaire et ubiquiste, alpha, qui est sécrétée et exprimée dans tout l'épiderme, ainsi que béta et gamma, qui sont sécrétées et dont l'expression est restreinte à la couche granuleuse de l'épiderme. La séquence de ces isoformes ne permettant pas, par analyse bioinformatique, de prédire leur fonction, nous avons développé la méthode de double hybride chez la levure pour rechercher des partenaires potentiels. Nous avons identifié la petite GTPase Rab5 comme partenaire de la forme intracellulaire DMKNdelta. Rab5 est principalement localisée au niveau des endosomes précoces et participe au trafic endomembranaire. Elle présente deux conformations : liée au GTP (état actif) ou liée au GDP (état inactif). L'interaction de DMKNdelta avec les formes actives et inactives de Rab5 a été confirmée in vitro par des expériences de « GST pull-down ». In vivo, DMKNdelta colocalise majoritairement avec la forme inactive de Rab5. De plus, l'expression de DMKNdelta en fusion avec la GFP dans les cellules HeLa induit la formation de vésicules dans lesquelles elle colocalise partiellement avec Rab5 endogène et avec la clathrine, suggérant l'implication de DMKNdelta dans les étapes précoces de l'endocytose. Enfin, nous avons montré que DMKNdelta favorise la liaison de la petite GTPase au GTP et donc son activation, et qu'elle stimule l'endocytose de la transferrine. Ce travail montre que la DMKNdelta active Rab5 et joue un rôle dans l'endocytose précoce. Dans l'épiderme hyperprolifératif comme, par exemple, dans les lésions psoriasiques ou l’épiderme cicatriciel de souris, l’expression des DMKNbéta/gamma n'est plus restreinte aux seuls kératinocytes granuleux mais s'étend à un nombre accru d'assises suprabasales. Ces résultats, associés à l'augmentation du taux des transcrits DMKNbéta/gamma après irradiation de cellules HaCaT par rayonnement UVB, suggèrent un rôle pour ces protéines dans la fonction de barrière de l'épiderme. En outre, nous avons mis en évidence par double hybride chez la levure, et confirmé par « GST pull-down », une interaction entre le domaine riche en glycine et sérine des DMKNdelta/gamma et le domaine non lectine de la galectine-3. Cette lectine animale ubiquiste et pléiotrope peut être sécrétée par une voie non classique. Dans le milieu extracellulaire, elle interagit avec de nombreuses protéines de la matrice, via son domaine lectine et sa partie N-terminale. L'analyse immunohistologique de coupes de peau humaine montre que la galectine-3 est fortement exprimée dans la couche granuleuse, où elle colocalise avec les DMKNdelta/gamma. Le rôle de la galectine-3 dans l'épiderme est encore mal connu. L'existence d'un réseau de protéines extracellulaires, impliquant entre autres DMKNdelta/gamma ainsi que la galectine-3, pourrait jouer un rôle, encore largement inexploré, dans les étapes tardives de la différenciation épidermique. En effet, nous avons mis en évidence par PCR quantitative en temps réel que certains gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire sont transcrits, et donc potentiellement traduits, dans les couches suprabasales de l'épiderme humain. La poursuite de la caractérisation fonctionnelle des DMKNdelta/gamma dans l'espace extracellulaire des couches granuleuse et cornée s'appuiera entre autre sur un modèle de souris invalidées pour le gène Dmkn que nous avons récemment obtenu.

  • Titre traduit

    Fonctional analysis of the different isoforms encoded by the Dermokine gene


  • Résumé

    Corneocytes, highly coherent dead cells embedded in lipid lamellae, compose the most superficial layer of the epidermis, namely the cornified layer, which is responsible for the barrier function of the skin. Corneocytes arise from cornification, a special cell death. Thus, components of these cells and their extracellular space are mainly synthesized by the underlying living layer composed of granular keratinocytes. Surprisingly, one of the most represented transcript of this layer encodes dermokine (DMKN), a protein with unknown function. DMKN undergoes a complex alternative splicing, leading to four isoform types: delta is intracellular and ubiquitous, alpha is secreted and expressed in whole epidermis, whereas béta and gamma are secreted and expressed only in the granular layer of the epidermis. As bioinformatic analysis of their sequences gave no clues to predict their functions, we used the yeast two-hybrid system to identify potential partners. We found the small GTPase Rab5 as partner for the intracellular DMKNdelta. Rab5 is mainly localized on early endosomes and is a key actor in endomembrane trafficking. It cycles between an inactive (GDP-bound) and an active (GTP-bound) state. DMKNdelta interaction with active and inactive forms of Rab5 were confirmed in vitro by GST pull-down experiments. In vivo, DMKNdelta colocalizes mainly with GDP-Rab5. Transient expression of GFP-tagged DMKN? in HeLa cells led to the formation of punctate structures colocalized with endogenous Rab5 and clathrin, indicating DMKNdelta involvement in the early steps of endocytosis. Moreover, DMKNdelta promotes GTP loading onto the small GTPase, which leads to Rab5 activation. DMKNdelta expression also stimulated the endocytosis of transferrin. Together our data reveal that DMKNdelta activates Rab5 function and thus is involved in the early endosomal trafficking. In hyperproliferative epidermis, as in psoriatic lesions or during mouse skin wound healing, DMKNbéta/gamma are expressed by more cell layers than in normal epidermis, and are concentrated at the apical poles of the cells. These results combined with DMKN up-regulation after UVB irradiation of HaCat cells suggest a role in the barrier function. We identified with the yeast two-hybrid system, and confirmed by GST pull-down experiments, an interaction between the non-lectin domain of galectin-3 and the glycine and serine rich domain common to both DMKNbéta/gamma. This ubiquitous and pleiotropic lectin can be secreted by the non-classical pathway. In the extracellular space, numerous proteins interact with either the carbohydrate recognition domain or the N-terminal domain of galectin-3. Immunohistochemical analysis of human skin section shows that galectin-3 is highly expressed in the granular layer, where it colocalizes with both DMKNbéta/gamma. Galectin-3 function in the epidermis is still unknown. An extracellular protein scaffold, involving DMKNdelta/gamma and galectin-3 along with others, could play a largely unexplored role in the late steps of epidermis differentiation. Actually, we showed by real time PCR that some genes encoding extracellular matrix proteins are transcribed, and thus potentially translated, in the suprabasal layers of human epidermis. Characterization of DMKNdelta/gamma function in the extracellular space of the granular layer will be pursued using a mouse model invalidated for the DMKN gene we recently obtained.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (263 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 237-263

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2010 TOU3 0304
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 8154
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