Synthèse de mannodendrimères, analogues de la structure supramoléculaire du lipoarabinomannane mannosylé (ManLAM) et étude de leurs propriétés anti-inflammatoires

par Emilyne Blattes

Thèse de doctorat en Biochimie structurale et fonctionnelle

Sous la direction de Anne-Marie Caminade et de Germain Puzo.

Soutenue en 2010

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Le lipoarabinomannane mannosylé (ManLAM) est un lipoglycanne de l'enveloppe cellulaire de M. Tuberculosis. Depuis une décennie, nous savons que ce lipoglycanne isolé possède in vitro et in vivo des propriétés anti-inflammatoires. Ce composé est capable d'inhiber la production d'L-12 et de TNF-alpha, par des cellules dendritiques humaines (DCs) stimulées au LPS. In vitro, l'activité de ce lipoglycanne est corrélée au récepteur DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non-integrin, une lectine de type C retrouvée à la membrane des DCs. Il prévient également, in vivo, le désordre respiratoire causé par l'asthme allergique chez la souris. Structuralement, le ManLAM est une macromolécule amphiphile (17kDa) composée d'une ancre mannosyl-phosphatidyl-myo-inositol (MPI) sur laquelle est greffé un squelette polysaccharidique. Ce dernier porte à ses extrémités des coiffes oligomannosylées de type mono-, di- et trimannosides d'enchainement alpha(1 dans 2). L'ancre MPI et les coiffes mannosylées sont les déterminants structuraux indispensables à l'activité du ManLAM, in vitro et in vivo. L'ancre MPI permet l'agrégation en solution des molécules de ManLAM, en micelle de 30 nm de diamètre où à leur surface, serait présenté les coiffes oligomannosylées. Il apparaît donc que la forme supramoléculaire du ManLAM en solution soit la forme bioactive immunomodulatrice. Le travail de thèse concerne la synthèse de dendrimères mannosylés mimes de l'organisation supramoléculaire du ManLAM en solution, présentant des propriétés anti-inflammatoires similaires. Les dendrimères sont des macromolécules synthétiques hyperbranchées et monodisperses, issus d'une synthèse organique extrêmement contrôlée. Nous avons utilisés dans ce projet des dendrimères phosphorés comme un équivalent du cœur de la micelle de ManLAM, à la surface desquels sont greffés différents oligomannosides de synthèse, identiques aux coiffes du ManLAM. Nous avons synthétisé 8 dendrimères mannosylés, de quatre tailles différentes (de la 1er (Gc1) à la 4ème (Gc4) génération) avec des Mono-, des Di- ou des Trimannosides à la surface. Cette synthèse multi-étapes est maitrisée et générale, et permet d'obtenir des quantités de molécules hydrosolubles compatibles avec des essais biologiques. De plus, ces mannodendrimères sont tous des ligands du récepteur DC-SIGN soit sous forme soluble soit sous forme membranaire. Cette étude fait émerger les composés Gc3Di, Gc4Di et Gc3Tri comme des ligands de haute affinité pour DC-SIGN, affinité comparable à celle de la forme supramoléculaire du ManLAM. Ces mannodendrimères semblent être spécifiques de DC-SIGN, du fait de la faible liaison de Gc4DiF, homologue fluorescent de Gc4Di, aux récepteurs SIGNR3 et MR. Gc3Tri et Gc4Di présentent également un caractère anti-inflammatoire ex vivo. Lors d'une co-incubation de DCs avec le LPS et Gc3Tri ou Gc4Di nous avons observé une inhibition de la production de TNF-alpha par ces cellules. Comme le ManLAM, cette inhibition est dose-dépendante et annihilée, pour Gc3Tri, par un anticorps bloquant DC-SIGN. Enfin, le mannodendrimère Gc3Tri prévient l'inflammation des poumons murins induite par inhalation de LPS, comme le ManLAM. Ces résultats prometteurs nous permettent de penser que Gc3Tri correspond à un mime synthétique de la forme bioactive du ManLAM, à la fois in vitro mais aussi in vivo.

  • Titre traduit

    Synthesis of mannodendrimers, chemical analogues of ManLAM supramolecular structure and study of their anti-inflammatory properties


  • Résumé

    The mannosylated lipoarabinomannan (ManLAM) is a component of M. Tuberculosis cell wall. This purified lypoglycan present in vitro and in vivo anti-inflammatory properties. It is able to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-alpha from LPS activated human Dendritic Cells (DCs). In this way, ManLAM activity is correlated through its ligation to the DC-SIGN receptor (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non-integrin), a C-type lectin found on DCs membrane. In vivo, purified ManLAM also prevent mouse respiratory disorder caused by allergic asthma. ManLAM is an amphiphilic macromolecule (17kDa) composed of a mannosyl-phosphatidyl-myo-inositol (MPI)anchor on which a ramified polysaccharide skeleton is grafted. Terminal oligo-mannosyl caps, mono-, alpha(1 in 2)-di-, and alpha(1 in 2)-trimannopyranosides are found at the non-reducing end of this polysaccharide. Both MPI anchor and oligomannosyl caps play a crucial role in the in vitro and in vivo ManLAM anti-inflammatory activity. Indeed, MPI anchor triggers the self-aggregation of ManLAM molecules in solution, forming micelle-like structures of around 30 nm diameters. At the surface, are exposed the oligommanosyl caps interacting with C-type lectin, like DC-SIGN. In this way, it seems that the ManLAM bioactive form is the supra-molecular structure in solution. The present project described deals with the synthesis of mannosylated dendrimers, ManLAM micelles mimics presenting similar anti-inflammatory properties. Dendrimers are mono-disperse, poly-functionalized, and hyper-branched macromolecules whose nanometer size, perfectly defined structure, multivalent character, and molecular weight can be controlled rigorously during synthesis. In this project phosphorus containing dendrimers were used as a support, representing the ManLAM micelle interior. At their surface, synthetic oligomannosides, identical to the ManLAM caps were grafted. Here, we have prepared 8 mannosylated phosphorus containing dendrimers of four different sizes(first (Gc1) to fourth (Gc4) generation) with Mono-, Di- and Trimannopyranosides at their surface. This multi-step synthesis is totally controlled and general which allowed the formation of tens of milligrams of compounds. We have demonstrated that every mannodendrimer is a DC-SIGN receptor ligand, thanks to binding tests using soluble or membrane DC-SIGN. Three of them, Gc3Di, Gc3Tri and Gc4Di, are high affinity ligands like ManLAM supra-molecular structure. Moreover these mannodendrimers seems to be specific of DC-SIGN receptor. In fact, Gc4DiF, fluorescent homolog of Gc4Di, weakly interacts with two other C-type lectins SIGNR3 and MR. Gc3Tri and Gc4Di have also some anti-inflammatory properties. Ex vivo, promising results were obtained on human monocytes derived dendritic cells activated by LPS. During co-incubation, Gc3Tri or Gc4Di can inhibit TNF-alpha production by these cells as previously described for the ManLAM, via DC-SIGN and in a dosedependent manner. Gc3Tri is also able to activate DC-SIGN signaling pathway by inducing Raf-1 kinase phosphorylation. Finally, Gc3Tri does prevent lung inflammation of mice induced by LPS inhalation, like ManLAM. All these promising results allow us to think that Gc3Tri is a synthetic mimic of ManLAM supra-molecular bioactive form, both in vitro and in vivo.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (235 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 221-235

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2010 TOU3 0296
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