Study of pontin and reptin in vitro activities

par Anna Kalashnikova

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Mikhail Grigoriev.

Soutenue en 2010

à Toulouse 3 .


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  • Résumé

    Les protéines essentielles Tip49 (pontin et reptin) font partie de la famille AAA+ (" ATPases associated with diverse cellular activities ") qui est composée d'enzymes impliqués dans des processus cellulaires divers. La propriété commune de ces enzymes semble être la capacité d'effectuer un remodelage des protéines et/ou d'acides nucléiques en consommant de l'ATP. Dans ce but, les protéines AAA+ portent des domaines conservés de liaison et d'hydrolyse de l'ATP - Walker A et B et Sensor I et II. Les protéines TIP49 sont hautement conservées à travers l'évolution (70% d'identité entre les protéines humaines et celles de la levure) et très similaires entre elles (40% d'identité). Malgré leur forte homologie, chacune des deux protéines est essentielle chez les eucaryotes. Leurs partenaires protéiques suggèrent qu'elles soient requises dans de nombreux processus cellulaires générant de l'ADN simple brin (réparation, recombinaison, réplication, transcription, remodelage de la chromatine et biogenèse des snoARN). Les premiers travaux sur les protéines purifiées les ont décrites comme des hélicases possédant une activité ATPase induite par l'ADN simple-brin. Depuis, la capacité à hydrolyser l'ATP des protéines purifiées a été fortement débattue et la fonction exacte de ces protéines reste complètement inconnue. Le projet sur lequel j'ai travaillé sous la direction de Dr. M. Grigoriev était une caractérisation en détail in vitro des activités enzymatiques des protéines TIP49 afin de comprendre leur mode d'action dans ces nombreux processus. Résultats : Afin de déterminer leur propriétés biochimiques, nous avons purifié des fractions hexamèrique et monomérique des protéines pontin et reptin. Nous avons trouvé que les monomères étaient actifs en hydrolyse de l'ATP. Cette activité ATPase est dépendante de l'ADN simple (ss) ou double brin (ds). Nous n'avons pas observé une activité ATPase pour la forme hexamérique. L'interaction entre l'ADNss et les protéines, responsable de l'activation de l'ATPase, a été observée par des expériences du retard sur gel. Nous avons montré que la reptin et la pontin lient l'ADN simple brin (ADNss) et l'ADN double brin (ADNds) de façon hautement coopérative. Les complexes formés entre la protéine et l'ADN sont hautement stables. Cette structure nucléoprotéique peut avoir un rôle biologique déterminé par sa stabilité. L'hexamère de reptin lie l'ADNss, mais les complexes hexamère-ADNss ne migrent pas de même façon qu'un complexe monomère-ADNss. En plus, la liaison était beaucoup moins efficace. Ces complexes hautement stables monomère reptin- ADNss peuvent être déstabilisés en présence de cofacteurs nucléotidiques - ADP ou ATP. Cette déstabilisation est accompagnée par l'apparition de bande sur le gel retard correspondant à celle d'hexamère. En présence de l'ATP un complexe met plus longtemps pour se déstabiliser - délai qui peut correspondre au temps nécessaire pour hydrolyser de l'ATP en ADP. Nous avons démontré la capacité de séparer deux brins dans le substrat contenant la partie simple et double brin en présence de l'ATP. Nous avons étudié cette activité hélicase dans les détails. Cette activité est spécifique de substrats 3'-5'. Nous avons démontré que la protéine reptin avait besoin de queues d'ADNss de 30 nucléotides minimum pour se charger sur le substrat et pour l'initiation de la réaction, tandis que la protéine pontin, à son tour, avait besoin l'ADNds assez long pour que la réaction soit efficace. De façon inattendue, nous avons mis en évidence aussi une activité endonucléase spécifique de l'ADNss dans la fraction hexamérique de la protéine. Comme nous avons dit, l'ADP est apparemment nécessaire pour la structuration de la forme hexamèrique. En accord avec ces résultats, nous avons pu voir l'induction de l'activité nucléase dans la fraction monomérique en présence d'ATP ou d'ADP. Pour mieux comprendre la relation entre les activités ATPase, hélicase et nucléase, nous avons nous avons obtenu les mutants ponctuels DEVH -> NEVH de reptin et pontin dans les régions Walker B - domaines qui participent à l'hydrolyse de l'ATP ainsi que un mutant ponctuel de pontin dans une région Sensor II. Nous avons montré que ces mutations déstabilisent l'équilibre entre l'état hexamérique et monomérique. De plus, les activités hélicase, ATPase et nucléase sont modifiées. Pris dans leur ensemble, ces résultats des travaux nous permettent de suggérer que l'oligomérisation des protéines pontin et reptin est hautement importante dans la contrôle de transition d'activité hélicase vers l'activité nucléase. Ces résultats servent à mieux comprendre leurs fonctions exactes dans les diverses voies métaboliques de l'ADN dans lesquelles elles sont impliquées.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (149 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 137-149

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2010 TOU3 0169
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