Study of protein-protein and protein-membrane interactions leading to the channeling of metabolic fluxes in phenylpropanoid metabolism in Arabidopsis thaliana, involving cytochromes P450 from CYP73A and CYP98A families : Functional analysis of CYP98As and CYP73As paralogues in Nicotiana tabacum

par Jean-Etienne Bassard

Thèse de doctorat en Sciences du Vivant. Biologie Cellulaire et Moléculaire Végétales

Sous la direction de Danièle Reichhart.

Soutenue en 2010

à Strasbourg .

  • Titre traduit

    Etude des interactions protéine-protéine et protéine-membrane permettant la canalisation des flux métaboliques dans la voie des phénylpropanoïdes chez Arabidopsis thaliana, mettant en jeux des cytochromes P450 des familles CYP73As et CYP98As : Analyse fonctionnelle des CYP73As et CYP98As chez Nicotiana tabacum


  • Résumé

    Les métabolons sont des complexes supramoléculaires constitués d’éléments structuraux et d’enzymes consécutives d’une voie de biosynthèse. De telles structures offrent de nombreux avantages pour l’organisation et l’efficacité des voies métaboliques et du métabolisme dans son ensemble. La formation de métabolons dans la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes est envisagée depuis de longues années. L’association/dissociation de ces derniers assurerait la canalisation des flux métaboliques entre les différentes branches constituant cette voie de biosynthèse. Deux cytochromes P450 membranaires, CYP73A5 et CYP98A3, ainsi que deux enzymes solubles, la p-coumaroyl :CoA ligase 1 (4CL-1) et l’hydroxycinnamoyl-CoA :shikimate hydroxycinnamoyl transférase (HCT), sont des éléments clé dans la formation du métabolon spécifique de la voie de biosynthèse de la lignine. Ce métabolon a été étudié in vitro par reconstitution sur nanodisques lipidiques, ainsi que par imagerie confocale sur des cellules épidermiques de Nicotiana benthamiana exprimant transitoirement des protéines de fusion fluorescentes. Ce travail a révélé des propriétés non décrites des enzymes cibles, comme le mouvement rapide des P450 ancrés au réticulum endoplasmique (RE), ou l’interaction de 4CL-1 et HCT avec les membranes artificielles ou cellulaires. In vivo, une relocalisation vers le RE des enzymes solubles a été observée en présence des P450s. Des interactions protéine-protéine ont été mises en évidence entre protéines membranaires et solubles, et furent accrues lors de la co-expression de l’ensemble des partenaires du métabolon. Ce travail a également permis de démontrer une homo- et une hétéro-oligomérisation des CYP73A5 et CYP98A3. CYP98A3 semble jouer un rôle déterminant pour la formation du métabolon. Ce travail souligne le caractère extrêmement dynamique du métabolon. En parallèle, une analyse fonctionnelle des familles CYP98 et CYP73 a été réalisée chez N. Tabacum. Une caractérisation fonctionnelle précise des divers membres de ces familles n’a pas pu être réalisée en raison de leur faible expression en système recombinant. En revanche, les patrons d’expression des différents membres de ces familles chez le tabac sain ou stressé indiquent une spécialisation fonctionnelle des différents paralogues.


  • Résumé

    Metabolons are supramolecular complexes of sequential metabolic enzymes and cellular structural elements. This organization of metabolic pathways at the molecular level is expected to have several advantages on the metabolism efficiency. The existence of metabolons in the phenylpropanoid pathway was proposed many years ago. Metabolons association and dissociation was proposed to coordinate fluxes in the different branches of this complex pathway. Two membrane-anchored cytochromes P450, CYP73A5 and CYP98A3, and two soluble enzymes, the p-coumaroyl:CoA ligase 1 (4CL-1) and the hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate hydroxycinnamoyl transferase (HCT), are expected to play essential roles in the lignin branch metabolon. The formation of this lignin metabolon has been investigated by in vitro reconstruction on lipid nanodiscs, and by confocal microscopy on N. Benthamiana epidermal cells after transient expression of fluorescent fusion proteins. This work revealed unexpected features of the target enzymes, including fast movement of the P450 enzymes with the plant endoplasmic reticulum (ER) and membrane binding of 4CL and HCT, independent from the presence of the P450 proteins. It also indicated membrane relocalization of soluble enzymes in vivo in the presence of their partner proteins and demonstrated direct protein/protein interactions that were enhanced when CYP73A5, CYP98A3 and their two soluble partners were co-expressed in the same cells. This work also revealed P450 homo- and hetero-oligomerization and suggests that CYP98A3 plays an essential role in the formation of the lignin metabolon. These data underscore a very dynamic model for plant metabolon. In parallel, functional investigations on the members of the CYP98 and CYP73 families in Nicotiana tabacum have been carried out. Enzyme functions could not be precisely described due to their low expression in the recombinant system. The different expression patterns of the paralogues in healthy or stressed tobacco plants were, however, clearly indicative of their subfunctionalization.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (XVIII-352 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 285-307

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2010;0864
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