Site-specific photo-proteolysis of proteins and peptides by incorporation of unnatural amino acid : Synthesis and characterization of photo-activatable α-amino acid

par Portia Duodu

Thèse de doctorat en Chimie organique

Sous la direction de Maurice Goeldner.

Soutenue en 2010

à Strasbourg .

  • Titre traduit

    Photo-protéolyse site-spécifique de peptides et de protéines par incorporation d'acide aminé non naturel : Synthèse et caractérisation de sondes α-amino acids photoclivables


  • Résumé

    Les structures protéiques impliquées dans les phénomènes physiologiques comme la coagulation sanguine, l’apoptose ou la signalisation membranaire, nécessitent souvent une activation préliminaire de leurs formes pro-protéines inactives. Le présent travail de thèse s’inscrit dans le domaine de la biochimie, et porte sur le développement d’une photo-protéase comme un outil moléculaire original et efficace pour l’étude dynamique de protéines par photorégulation de leur activité. Les photo-protéases adoptent un concept identique à celui des précurseurs photolabile de biomolécules; En effet, l’irradiation d’une séquence peptidique modifiée au préalable avec un acide aminé photolabile permettra un clivage specifique de la chaîne polypeptidique au niveau du site d’incorporation de cet amino acide, libérant ainsi une séquence fonctionnelle. L’avantage majeur de cette méthodologie étant une protéolyse ciblée, contrôlée, et inoffensive pour l’organisme à la longueur d’onde utilisée (λ>300nm). L’isomère optiquement actif de l’acide aminé photosensible DMNPA a été synthétisé et ses propriétés de clivage ont été évaluées sur des peptides modèles. L’étude de la réaction photochimique a démontré une sonde UV intéressante pour une protéolyse ciblée in vivo. Dans un deuxième temps une méthode alternative permettant une “vraie protéolyse” par clivage de la liaison amide a aussi été développée. Ce système moléculaire de pointe est très adapté aux méthodes d’incorporation d’acide aminé dans des protéines notamment la méthode de suppression de codons stop, et devrait trouver des applications utiles dans le photo-déclenchement de processus biologiques in vitro comme in vivo.


  • Résumé

    Protein structures involved in post translational modifications of physiological events such as blood clotting, cell death and membrane signaling, mostly require proteolytic activation of their inactive proprotein forms. The present thesis work is a contribution to the biochemistry field, and focuses on the development of a photo-protease as an efficient molecular tool for protein dynamic studies. Photo-proteases adopt an identical concept as for “caged biomolecules”. In fact, illumination of a protein having its polypeptide backbone sequence mutated with a photoactivatable amino acid, induces cleavage of the polypeptide backbone at the specific site of incorporation of the unnatural amino acid, releasing thereof functional peptides/proteins. This methodology offers a spatio-temporal controlled proteolysis, with the use of light being harmless to most living tissues at λ>300nm. One such amino acid was conceived: DMNPA. A stereodivergent synthesis to optical isomers was established, and polypeptide backbone cleavage properties have been assessed on short peptidyl sequences. Photolysis of model peptides revealed a near-UV probe interesting for targeted proteolysis in living cells. We have also developed an original two-step processing reaction leading to efficient amide bond cleavage after UV illumination. Thus a new and efficient biomolecular tool is now accessible for site-specific proteolysis. This state of the art molecular system, is very adapted to current methods of cell delivery of bioagents, notably the nonsense codon suppression methodology, and should find useful applications in phototriggering physiological events in vitro likewise in vivo.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (XIV-186 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Notes bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2010;0661
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