Fonction et structure du complexe entre l'intégrase du VIH-1 et deux protéines cellulaires (LEDGF et INI1)

par Benoît Maillot

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Marc Ruff.

Soutenue en 2010

à Strasbourg .


  • Résumé

    Le génome viral inversement transcrit du VIH-1 (Virus de l’Immunodéficience Humaine type 1 est intégré dans le génome de la cellule cible par l’intégrase, une protéine virale de 288 acides aminés. L’intégrase est partie intégrante d’un important complexe nucléoprotéique, le complexe de pré-intégration (CPI). Ce complexe est formé après la reverse transcription dans le cytoplasme de la cellule infectée. Il migre par l’intermédiaire des microtubules jusqu’à l’enveloppe nucléaire où il est transporté dans le noyau à travers le pore nucléaire. Le CPI est composé d’ADN et de protéines virales dont l’intégrase. D’autres protéines virales (VPR, NC, CA) et des protéines cellulaires participent à ce complexe. Parmi les protéines cellulaires identifiées s’illustrent notamment LEDGF (Lens Epithelium-Derived Growth Factor) et INI1 (INtegrase Interactor 1). Cette protéine aussi appelée SNF5 est une composante du complexe SWI-SNF de remodelage de la chromatine. Mon travail de thèse s’articule autour de la résolution de structures tridimensionnelles de l’intégrase du VIH-1 en complexe avec LEDGF et INI1. Mon sujet consistait à réaliser une stratégie permettant d’aboutir à la formation in vitro de ce complexe. Par une analyse bioinformatique de la protéine INI1, j’ai défini les limites de différents domaines potentiellement stables d’INI1 contenant le domaine de liaison à l’intégrase (IBD). Après clonage et expression dans le système bactérien E. Coli. J’ai mis au point la production à grande échelle et la purification des fragments ayant la meilleure solubilité. Après avoir obtenu un complexe stable, J’ai résolu la structure du complexe ternaire entre l’intégrase pleine longueur type sauvage, LEDGF et l’IBD d’INI1 par microscopie électronique. Les structures cristallographiques connues des domaines de l’intégrase ont été positionnées dans la carte de densité électronique. J’ai mis au point des tests fonctionnels originaux basées sur les techniques d’anisotropie de fluorescence qui m’ont permis de tester l’affinité du complexe pour l’ADN ainsi que l’activité enzymatique de 3’processing. Les résultats indiquent qu’au sein du complexe ternaire, l’IBD de INI1 réduit significativement l’affinité pour l’ADN cible et dans une moindre mesure l’affinité pour l’ADN viral. De plus, l’IBD d’INI1 inhibe totalement la réaction de 3’processing. La structure du complexe ternaire nous permet de visualiser les postions relatives des différentes protéines dans le complexe. On montre que le complexe est formé de 4 molécules d’intégrase, deux molécules de LEDGF et deux molécules d’INI1. La combinaison de ces résultats avec les tests fonctionnels nous permettent de proposer un modèle et un rôle pour INI1 qui serait d’empêcher l’auto intégration de l’ADN viral sur lui-même quand le CPI se trouve dans le noyau cellulaire.

  • Titre traduit

    Function and structure of the complex between HIV-1 integrse and two cellular partners (LEDGF, INI1)


  • Résumé

    The viral genome reverse transcribed from the HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus type I) is integrated in the target cell genome by the integrase, a viral protein of 288 amino acids The integrase is a part of an important nucleo- proteique complex, the preintegration complex (PIC). This complex is formed after the reverse transcription in the cytoplasm of infected cells. It migrates along the microtubules up to the nuclear envelope where it is carried in the nucleus through the nuclear pore. The PIC is composed of DNA, and viral proteins including integrase. Other viral proteins (VPR, NC, CA) and cellular proteins are part of this complex. Among the cellular proteins, two of them are the object of this work: LEDGF (Lens Epithelium-Derived Growth Factor) and INI1 (INtegrase Interactor 1). This last protein, also called SNF5, is a component of the SWI-SNF chromatin remodeling complex. The object of my PhD work is the understanding of the structure function relationship with the 3D structure solving of the complex between HIV-1 integrase in complex with LEDGF and INI1. I set up a strategy to reconstitute this complex in vitro. Using a bioinformatic approach, I defined the limits of domains, containing the region interacting with integrase, potentially stable of INI1 After cloning and expression in E. Coli, I set up the production and purification of the more soluble fragments. After obtaining a stable complex I solved by electron microscopy the structure of the complex between the integrase, LEDGF and INI1. The known crystallographic structures of the integrase domains where fitted in the EM map. I set up functional tests based on fluorescence anisotropy, which permit us to test the affinity of the complex for DNA and the 3’processing activity. The results show that INI1 reduces the affinity for the target DNA and for the viral DNA. Moreover INI1 inhibits totally the 3’ processing reaction. The structure of the ternary complex shows the relative position of the different proteins in the complex. We show that the complex is made of 4 integrases molecule, 2 LEDGF and 2 INI1 molecules. The comparison of these results with the functional tests allows us to propose a model and a role for INI1 which would be to prevent the auto integration of the viral DNA on itself when the PIC is in the nucleus.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (148 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 138-148

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2010;0625
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