Etude multicentrique de nouveaux marqueurs tumoraux moléculaires dans les épanchements péritonéaux et le sang : analyse par PCR quantitative en temps réel

par Fauzia Mohamed

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Christian Genin.

Le président du jury était Pierre Seffert.

Le jury était composé de Stéphane Paul, Frédérique Penault-Llorca.

Les rapporteurs étaient Stéphane Ansieau, Dominique Bernard-Gallon.


  • Résumé

    La progression naturelle des tumeurs consiste en une extension locale, puis à distance (métastase) par migration de cellules dans le sang et la lymphe vers des sites secondaires. Il est donc primordial de pouvoir détecter des cellules tumorales circulantes en plus de l’analyse morphologique et de l’immunocytochimie. De plus, deux technologies (cytométrie en flux et RT-PCR quantitative en temps réel) sont adaptées pour une analyse automatisée, rapide et sensible d’une très faible quantité de cellules. Le but de notre travail a été de mettre au point des systèmes de détection pour l’identification de cellules cancéreuses dans les épanchements péritonéaux et dans le sang. L’étude des biomarqueurs moléculaires apparaît comme une approche complémentaire intéressante pour améliorer l'efficacité du diagnostic dans ce type d'échantillons biologiques. Nous nous sommes intéressés à la mise en évidence de nouveaux marqueurs tumoraux qui pourront être utilisés pour le diagnostic précoce et le pronostic des cancers en utilisant les nouvelles techniques de biologie moléculaire. Il est probable que l'utilisation de multiples marqueurs moléculaires puisse permettre d’évoquer plus particulièrement certains types de cancers. Nous avons pu mettre en place une technique de PCR quantitative en temps réel, nettement plus sensible que la cytologie classique, et nous avons appliqué cette technique à l'étude de marqueurs tumoraux dans les liquides d’épanchement, mais aussi dans le sang pour rechercher et doser l’ARN messager. Nos résultats montrent que la cytométrie en flux adaptée à des lignées cellulaires ne l’est pas pour des prélèvements cliniques. Par la PCR quantitative, il a été possible de quantifier le niveau d’expression des marqueurs tumoraux étudiés en utilisant des plasmides de référence qui ont été préparés pour chaque gène. Plusieurs marqueurs permettent de différencier des épanchements malins et des épanchements bénins, mais surtout les antigènes CLDN4 et Ep-CAM étaient significativement plus élevés (68% et 57%, respectivement) chez les patients avec épanchements malins. L’ARN messager circulant de la CLDN4 était détectable et significativement plus élevée dans les sérums de patients atteints de cancer du sein (64% p<0,05). Les résultats indiquent que l'utilisation d'une combinaison de marqueurs comportant laclaudine 4 est plus susceptible de détecter des cellules malignes et d'être utiles pour le suivi de patients

  • Titre traduit

    Multricentric study of new molecular tumor markers in the peritoneal effusions and in the blood : analysis using quantitative real-time RT-PCR


  • Résumé

    The natural progression of tumors is a local extension, and remotely (metastasis) by migrating cells in the blood and the lymph to secondary sites. It is therefore essential to detect circulating tumor cells in addition to morphological analysis and immunocytochemistry. In addition, two technologies (flow cytometry and RT-PCR in real time) are suitable for a rapid and sensitive automated analysis of a very small quantity of cells. The aim of our work was to develop detection systems for identification of cancer cells in peritoneal effusions and blood. The study of molecular biomarkers appears as an attractive complementary approach to improve the efficiency of diagnosis in this type of biological samples. We are interested in the identification of new tumor markers that can be used for early diagnosis and prognosis of cancer using new techniques of molecular biology. It is likely that the use of multiple molecular markers can help to raise some specific types ofcancers. We were able to develop a quantitative PCR technique in real time, significantly more sensitive than conventional cytology, and we applied this technique to the study of tumor markers in effusions, but also in blood for detecting messenger RNA. Our results show that flow cytometry well-adapted to cell lines, is not unusable for clinical specimens. For quantitative PCR, it was possible to quantify the expression levels of tumor markers using reference plasmids prepared for each gene. Several markers can differentiate malignant and benign effusions, but especially CLDN4 and Ep-CAM antigens were significantly higher (68% and 57% respectively) in patients with malignant effusions.The circulating CLDN4 mRNA was detectable and significantly higher in the sera of patients with breast cancer (64% p <0.05). The results indicate that using a combination of markers including claudin 4 is more likely to detect malignant cells and be useful for monitoring patients


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