Les complexes supramoléculaires d'aminoacyl-ARNt synthétases impliqués dans la machinerie traductionnelle : du nématode à l'homme

par Svitlana Havrylenko

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Marc Mirande et de Boris Negrutskii.

Soutenue en 2010

à Paris 11 en cotutelle avec Kiev, Institut de biologie moléculaire et de génétique , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des Sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié l'organisation structurale des aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs), enzymes responsables de la lecture du code génétique, chez l'homme et chez le nématode Caenorhabditis elegans. Ces études ont porté sur l'analyse d'une synthétase individuelle, la méthionyl-ARNt synthétase de C. Elegans, sur la caractérisation des complexes multisynthétasiques du nématode, et sur l'organisation subcellulaire des aaRSs dans la cellule humaine. La MetRS-Ce possède une longue extension polypeptidique C-terminale. Elle représente la fusion entre une MetRS minimale bactérienne et une composante du complexe multienzymatiques d'aaRSs (MARS) humain, la protéine p43. Pour déterminer le rôle de ce domaine, deux formes enzymatiques, surproduites chez E. Coli, ont été purifiées. Les paramètres cinétiques et j'affinité pour l'ARNt de la forme native et d'une forme délétée de son domaine C-terminal ont été déterminés. L'extension C-terminale de la MetRS-Ce, est un domaine fonctionnel de liaison des ARNt (tRBD). Bien que les tRBD des MetRS-Ce et MetRS-Hs ne soient pas orthologues, ils confèrent à la MetRS les mêmes propriétés séquestrantes de l'aa-ARNt, révélant un phénomène d'évolution convergente. Nous avons recherché l'existence de complexes multisynthétasiques chez le nématode C. Elegans. Sur l'arbre phylogénétique des métazoaires, C. Elegans appartient à l'embranchement des protostomes, distinct de la branche des deutérostomes conduisant à l'homme. L'analyse d'extraits de C. Elegans sur tamis moléculaire a montré que certaines aaRSs, dont la MetRS, se comportent comme des protéines de haute masse moléculaire. Nous avons isolé les partenaires de la MetRS par immunoprécipitation à l'aide d'anticorps dirigés contre la forme tronquée. Ils ont été identifiés par LC-MS/MS. Le complexe MARS-Ce comprend 8 aaRS. Ces résultats permettent de proposer un schéma d'évolution des structures multisynthétasiques, partant de la plus simple, le complexe à deux aaRS de la levure S. Cerevisiae, pour aboutir à la plus complexe connue à ce jour, le complexe MARS humain à neuf aaRS. Parmi les protéines associées à MARS-Ce, nous avons identifié le produit du gène mrsp-38, jusqu'à présent sans fonction connue, à la protéine d'échafaudage du complexe. L'analyse d'une souche mutante de C. Elegans, portant une délétion au niveau de ce gène, a révélé l'importance de l'intégrité de cette protéine pour l'association des composantes de MARS-Ce. Ce travail avait été initié chez C. Elegans car ce ver permet des études fonctionnelles in vivo dans un organisme multicellulaire. En combinant les outils d'extinction du gène endogène par RNAi et d'expression de transgènes après transformation par biolistique, nous avons pu tester in vivo si l'organisation en complexe MARS est essentielle au développement d'un organisme multicellulaire. Nous avons montré que seules les copies de MetRS qui s'associent à MARS-Ce complémentent une inactivation de la copie endogène. Des protéines ribosomales ont été copurifiées avec MARS-Ce. Chez l'homme, MARS-Hs est e��galement associé de façon transitoire à d'autres composants cellulaires, les polysomes et les filaments d'actine. Nous avons montré que l'association aux polysomes n'est observable que dans un contexte de synthèse protéique active, lorsque des cellules HeLa sont en phase exponentielle de croissance. De même, la désorganisation du complexe MARS-Hs par siRNA s'accompagne d'un phénotype de retard de croissance, lié à une diminution de l'efficacité traductionnelle. Ces données révèlent l'importance de l'organisation subcellulaire de l'appareil de traduction des eucaryotes supérieurs.

  • Titre traduit

    Supramolecular complexes of aminoacyl-tRNA synthetases in translation machinery : from nematode to human


  • Résumé

    This thesis is dedicated to the study of structural organization of aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs), a family of enzymes responsible for establishing the genetic code, in human and in the nematode Caenorhabditis elegans. Ln particular, our studies concerned the analysis of structure-function relationships of MetRS of C. Elegans, the characterization of multisynthetase complexes in the nematode, and the deciphering of subcellular organization of aaRS in human cells. MetRS of C. Elegans (MetRS-Ce) possesses a long C-terminal polypeptide extension. This enzyme represents the fusion between a minimal bacterial MetRS and a component of human MARS complex, the p43 protein. Ln order to determine the role of this domain, we purified two forms of the protein, the full-Iength species and a ΔC-truncated derivative, to determine their catalytic parameters in tRNA aminoacylation reaction and their relative affinity for tRNA. The C-terminal extension of MetRS-Ce is a functional tRNA-binding domain (tRBD). The tRBDs of human and nematode MetRS have distinct structural folds. They are not orthologs but they provide MetRS with similar tRNA-sequestering properties. Thus, functional convergence of human and nematode MetRS is the result of parallel and convergent evolution that might have been triggered by the selective pressure to invent processivity of tRNA handling in translation in higher eukaryotes. We searched for the presence of supramolecular complexes of aaRS in the nematode C. Elegans. According to metazoan phylogeny, C. Elegans belongs to protostomes, a phylum distinct from the deuterostome branch leading to H. Sapiens. The analysis of C. Elegans extracts by gel-filtration showed that some aaRS, among which MetRS, behave as high-molecular mass entities. We isolated the partners of MetRS-Ce by immunoprecipitation. They were identified by LC-MS/MS. MARS-Ce complex contains 8 aaRS. Its distinct composition gives insight into possible evolution pathways that led to the emergence of the MARS complex containing 9 aaRS in human, statting From the two-component complex in the yeast S. Cerevisiae. Among the proteins associated with MARS-Ce, we identified the product of the mrsp-38 gene of unknown function, to the scaffold protein of the complex. The analysis of a mutant strain carrying a deletion in the 3'end of this gene revealed the importance of integrity of this protein for association of MARS-Ce components. This work was initiated in C. Elegans in part due to the feasibility of functional studies in vivo in a multicellular organism. By combining tools of extinction of the endogenous gene by RNAi and ectopic expression of transgenic variants of MetRS, we couId test in vivo if the assembly into the MARS complex is essential for growth of a multicellular organism. We found that only copies of MetRS-Ce that associate with MARS-Ce complement the inactivation of the endogenous copy. Ribosomal proteins were copurified with MARS-Ce. Ln human, MARS-Hs is also transiently associated with other subcellular components, polysomes and actin filaments. We showed that association with polysomes can only be observed in exponentially growing HeLa cells, in the context of active protein synthesis. Also, disruption of the MARS complex by siRNA is accompanied with a growth retardation phenotype, which is related to a decreased rate of protein synthesis. These data reveal the importance of subcellular organization of translation machinery in higher eukaryotes.

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  • Détails : 1 vol. (204 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 183-204

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