Structural analysis of bacterial protein tyrosine kinases (by-kinases) and their substrates

par Jakub Gruszczyk

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Biologie structurale

Sous la direction de Sylvie Nessler.


  • Résumé

    Des tyrosine-kinases bactériennes atypiques (appelées BY-kinases) ont été identifiées comme constituant d'un complexe multiprotéique transmembranaire responsable de la synthèse et l'export des polysaccharides de la capsule bactérienne. Les BY-kinases s'autophosphorylent sur un cluster de tyrosine C-terminal et phosphorylent des protéines endogènes de la bactérie comme des UDP-sucres déshydrogénases impliquées dans la synthèse des précurseurs des exopolysaccharides. Les données structurales et fonctionnelles disponibles posaient la question de la conservation du degré d'oligomérisation et du mécanisme d'autophosphorylation entre BY-kinases de firmicutes et de protéobactéries. J'ai donc résolu la structure cristalline du domaine cytoplasmique de la BY-kinase Wzc de la protéobactérie E. Coli. Cette nouvelle structure montre que, comme la BY-kinase CapAB du firmicute S. Aureus, Wzc forme un anneau octamérique expliquant le mécanisme d'autophosphorylation intermoléculaire. Des mesures d'affinité par fluorimétrie m'ont également permis de montrer qu'une tyrosine interne Y569, initialement supposée réguler la trans-autophosphorylation du tyrosine-cluster, est directement impliquée dans la fixation du nucléotide. Nous montrons également qu'une boucle flexible riche en résidus basiques joue un rôle essentiel dans la synthèse de la capsule, probablement en interagissant avec d'autres protéines impliquées dans ce processus. De plus, j'ai résolu la structure cristalline de l'UDP-N-acétylmannosamine déshydrogenase CapO, substrat de la BY-kinase CapAB de S. Aureus. Cette structure révèle la formation d'un pont disulfure entre la cystéine catalytique C258 et le résidu C92 et la présence de potentiels sites de phosphorylation, Y89 et Y264, à proximité de ces deux cystéines. L'analyse de mutants est en cours afin d'élucider le mécanisme de régulation de cette enzyme. La comparaison avec les structures d'autres membres de cette famille de déshydrogénases permet également de mieux comprendre leur spécificité de substrat.

  • Titre traduit

    Analyse structurale des tyrosine-kinases bactériennes (BY-kinases) et leurs substrats


  • Résumé

    Atypical bacterial tyrosine kinases (BY-kinases) have been identified as part of a multiprotein transmembrane complex responsible of the biosynthesis and export of capsular polysaccharides. BY-kinases autophosphorylate on a C-terminal tyrosine cluster and phosphorylate endogenous bacterial proteins like UDP-sugar dehydrogenases involved in the synthesis of exopolysaccharide precursors. Available structural and functional data raised the question of the conservation of the oligomerization state and of the autophosphorylation mechanism between BY-kinases from proteobacteria and firmicutes. I thus solved the crystal structure of the cytoplasmic domain of the BY-kinase Wzc from E. Coli. This new structure shows that, like the BY-kinase CapAB from the firmicute S. Aureus, Wzc forms an octameric ring explaining the intermolecular autophosphorylation mechanism. Fluorimetric affinity measurements further allowed me to show that the internal tyrosine Y569, initially supposed to regulate tyrosine-cluster trans-autophosphorylation, is directly involved in nucleotide binding. We also show that a flexible loop rich in basic residues plays an essential role in capsule synthesis, most probably through interaction with other proteins involved in this process. Moreover, I solved the crystal structure of UDP-N-acetylmannosamine dehydrogenase CapO, the substrate of the BY-kinases CapAB from S. Aureus. The structure reveals the formation of a disulfide bridge between the catalytic cysteine C258 and residue C92 and the presence of potential phosphorylation sites, Y89 and Y264, close to these two cysteines. Mutational analysis is underway in order to elucidate the regulatory mechanism of this enzyme. Comparison with the structures of other members of this family of dehydrogenases also allows us to shed light on their specific substrate recognition.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (186 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 153-179

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2010)135
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 7702
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