Imagerie moléculaire quantitative en cellule vivante

par Luis Alvarez

Thèse de doctorat en Chimie. Chimie - Physique

Sous la direction de Fabienne Mérola.


  • Résumé

    L'ʹinterprétation correcte des données d'ʹimagerie par FRET en cellule vivante dans l'ʹétude de l'ʹassemblage de complexes enzymatiques membranaires tel que la NADPH oxydase, demande le développement de méthodologies quantitatives qui prennent en considération toutes les causes possibles de variation de l'ʹintensité de la fluorescence à l'ʹintérieur de la cellule vivante. Dans ce but, nous avons dans un premier temps étudié les conséquence de l'ʹexposition de la Cyan Fluorescent Protein (CFP) à certains dérivés réactifs de l'ʹoxygène (ROS en anglais) produits pendant l'ʹactivation de la NADPH oxydase. Nous avons également mis en place un système bi--‐‑modal de microscopie à haute sensibilité, BIOFLUOR, pour corréler les mesures de durée de vie et les intensités de fluorescence de la CFP dans des cellules ayant des très faibles niveaux d'ʹexpression de fluorophores adressés à la membrane. Dans la première partie de la thèse, la radiolyse g a été utilisée pour exposer la CFP recombinante à des quantités contrôlées de radicaux •OH et de O2•--‐‑. Après oxydation par •OH, la protéine montre un profil d'ʹélution modifié en RP--‐‑HPLC, tandis que la fluorescence de la CFP diminue significativement en intensité et en durée de vie, sans changements sur les spectres 'ʹexcitation et d'ʹémission. Ces perturbations photophysiques ne résultent pas d'ʹune modification chimique directe du chromopeptide de la CFP, mais proviennent d'ʹoxydations sur d'ʹautres résidus de la protéine. La spectrométrie de masse en tandem nous a permis d'ʹidentifier quelques cibles majeures d'ʹoxydation, notamment des résidus méthionine et tyrosine (M88, Y151, M218, M233, Y237 et soit Y143 ou Y145). Ces résultats montrent que les réactions d'ʹoxydation suivent des voies hautement spécifiques dans la protéine et qu'ʹelles ne sont pas uniquement contrôlées par l'ʹaccessibilité au solvant et la réactivité intrinsèque des résidus. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons couplé sur le même système de microscopie (i) une voie de détection TCSPC à haute sensibilité pour l'ʹimagerie FLIM, et (ii) un système calibré d'ʹimagerie d'ʹintensité de fluorescence en champ large qui permet la quantification absolue de nombre de molécules de fluorophore. Le système TCSPC--‐‑FLIM permet une mesure reproductible de la durée de vie de la CFP dans des cellules vivantes HEK 293, jusqu'ʹà des concentration de quelques μμMoles/L (dans le cytoplasme) , ou quelques fluorophores par μμm2 (à la membrane cellulaire). Ces limites sont contrôlées principalement par le niveau relatif de l'ʹautofluorescence des cellules. La durée de vie mesurée pour la CFP cytosolique est de 2. 45 ± 0. 07 ns, tandis que celle de la construction CFP adressée à la membrane est de 2. 33 ± 0. 02 ns. En accord avec les observations précédentes faites sur la CFP cytosolique (Grailhe et al, 2006), nous observons clairement une extinction systématique et concentration--‐‑dépendante de la CFP adressée à la membrane. Ces études ont posé les bases d'ʹune utilisation fiable des protéines fluorescentes comme senseurs chimiques dans des cellules vivantes dans des conditions de stress oxydant. Parmi ces travaux, des méthodologies innovantes pour l'ʹinvestigation des protéines fluorescentes par spectrométrie de masse à haute résolution ont été développées, tandis que des outils pour l’investigation quantitative de la physicochimie des cellules vivantes ont été mis en place.

  • Titre traduit

    Molecular quantitative live cell imaging


  • Résumé

    The reliable interpretation of live cell FRET imaging in the study of the assembly of membrane enzymatic complexes such as the NADPH oxidase requires the development of quantitative methods, taking properly into account all possible causes of fluorescence intensity variations inside the living cell. To this aim, we have first studied the consequences of Cyan Fluorescent Protein (CFP) exposure to some reactive oxygen species (ROS) produced during NADPH oxidase activation. We have also developed a highly sensitive bimodal microscope set--‐‑up, BIFLUOR, for the correlated measurements of CFP fluorescence lifetimes and intensities in cells expressing very low levels of membrane--‐‑ localised fluorophores. In the first part of the thesis, g--‐‑radiolysis was used to expose purified recombinant CFP to well controlled quantities of •OH and O2•--‐‑ radicals. After •OH oxidation, the protein displays a modified RP--‐‑HPLC elution profile, while the CFP fluorescence undergoes pronounced decreases in intensity and lifetime, without changes in its excitation and emission spectra. These photophysical perturbations do not result from a direct chemical modification of the CFP chromopeptide, but arise from oxidations at other residues in the protein. Tandem--‐‑mass spectrometry has allowed the identification of a few major oxidation targets, namely some methionyl and tyrosinyl residues (M88, Y151, M218, M233, Y237 and either Y143 or Y145). These results show that the oxidation reactions follow highly specific paths in the protein, that are not solely controlled by residue solvent accessibility and bulk--‐‑phase reactivity. In the second part of the thesis, we have coupled on the same microscope set--‐‑up (i) a highly sensitive TCSPC detection path for FLIM imaging, and (ii) a calibrated system for wide--‐‑field fluorescence intensity imaging allowing the quantification of absolute fluorophore molecule numbers. The TCSPC--‐‑FLIM system allows reproducible CFP lifetime measurements in living HEK293 cells, down to a few μμMoles/L (in the cytosol), or a few fluorophores per μμm2 (at the cell membrane). These limits are mainly controlled by the relative level of cell autofluorescence. The measured lifetime of cytolosic CFP is 2. 45 ± 0. 07 ns, while that of a membrane--‐‑bound CFP construct was 2. 33 ± 0. 02 ns. In agreement with previous observations made on cytosolic CFP (Grailhe et al 2006), we find clear evidence for a systematic concentration--‐‑ dependent quenching of membrane--‐‑targeted CFP, in the presence and absence of its FRET acceptor YFP. These studies have set the basis for a reliable use of fluorescent proteins in live cell chemical sensing under conditions of oxidative stress. Among this work, groundbreaking methods for the structural investigations of fluorescent proteins by high--‐‑resolution mass spectrometry have been developped, while some useful tools for the molecular and quantitative investigation of live cell physical--‐‑chemistry have been devised.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (171 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 156-162

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2010)3
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