Vectorisation lentivirale transitoire pour la thérapie génique et la transgénèse

par Dorothée Henriot

Thèse de doctorat en Biotechnologies

Sous la direction de Jacques Mallet.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Le transfert de gène est un outil puissant pour la transgénèse et la thérapie génique. Les lentivirus sont parmi les vecteurs de transfert les plus prometteurs. Mais leur capacité d'intégration pose un problème de biosécurité. L'intégration ciblée nécessite elle-même la vectorisation sécurisée et transitoire des facteurs de recombinaison en raison de leur toxicité en cas d'expression stable. Nous avons donc développé plusieurs systèmes de vecteurs lentiviraux permettant l'expression transitoire d'un transgène dans des cellules en arrêt de division ou en division. Le premier système développé est un vecteur non-intégratif. Nous avons montré que l'adjonction de séquences MAR ne permet pas d'améliorer le niveau d'expression du transgène. Puis nous avons comparé des vecteurs portant différentes mutations de l'intégrase et avons ainsi déterminé que les mutations D64V et LQ permettent une expression plus efficace du transgène que la mutation N. Nous avons également mis au point des systèmes de vectorisation lentivirale reposant sur des substrats protéiques ou ARN. La vectorisation protéique repose sur la fusion de la protéine d'intérêt à VPR ou à l'intégrase. Nous avons montré l'encapsidation de la recombinase PhiC31 fusionnée à VPR. Les systèmes de vectorisation sous forme ARN reposent sur l'inhibition du mécanisme de rétro-transcription par délétion du PBS ou mutation de la rétro-transcriptase. Nous avons réalisé pour les deux systèmes la vectorisation de transgènes rapporteurs et d'une enzyme de recombinaison Cre. Nous avons prouvés que les événements observés sont dus à l'ARN viral, que les vecteurs sont dépourvus de rétro-transcription et d'intégration résiduelle.

  • Titre traduit

    Transient lentiviral vectorization for gene therapy and transgenesis


  • Résumé

    Gene transfer is a powerful tool for both transgenesis and gene therapy. Lentivirus are among the most promising gene transfer vectors. However, the issue of their integrative properties is crucial in terms of biosafety. Targeted-integration protocols usually imply the use of recombination factors that should themselves be vectorized in a safe and transitory manner because of their potential toxicity when stably expressed. Thus, we developed several Systems of lentiviral vectors allowing transient expression of a transgene in arrested or dividing cells. The first System consists of a non-integrating lentiviral vector. In a first step, we demonstrated that the addition of MAR sequences do not improve the transgene expression level. Then we compared vectors bearing various mutations of the integrase (D64V, N and LQ) and demonstrated that thé D64V and LQ mutations allow for higher expression than the N mutation. In a second step, we developed lentivectors based on proteic or ribonucleic substrates. The proteic vectorization Systems are based on the fusion of the protein of interest to VPR or Integrase. We demonstrated that PhiC31 recombinase fused to VPR can be encapsidated into lentiviral virions. The ribonucleic vectorization is based on the inhibition of the retrotranscription mechanism of retroviruses by deletion of the PBS or mutation of the - retrotranscriptase. We showed for both Systems their ability to vectorize reporter as well as the Cre recombination enzyme. In parallel, we demonstrated that the observed recombination events were due to the viral RNA and that the vectors are lacking retrotranscription and integration activities.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (199 f.)
  • Annexes : Réf. p. 187-199

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  • Cote : TS (2010) 233
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