Mycobacterium abscessus : contribution à l'étude de la paroi et à la résistance aux antibiotiques

par Rachid Nessar

Thèse de doctorat en Analyse de génomes et modélisation moléculaire

Sous la direction de Brigitte Gicquel.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Dans la première partie de ma thèse nous nous sommes intéressés à l'étude de la résistance de M. Abscessus aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Nous avons démontré la présence de quatre différentes mutations dans i la partie 3'du gène rrs (T1406A, A1408G, C1409T and G1491T) qui code pour TARN 16S de l'opéron ARNr, et qui est présent en une seule copie chez M. Abscessus. Ces mutations conféraient un niveau élevé de résistance (>1 mg/ml) aux 2 deoxystreptamine aminoglycosides testés (kanamycine, amikacine, gentamycine et tobramycine) mais ne conférait pas de résistance à la streptomycine. Nous avons ensuite démontré le caractère récessif de ces mutations après avoir clone les différents gènes rrs mutés indépendamment dans les quatre positions (T1406A, A1408G, C1409T et G1491T) dans le vecteur réplicatif pNBVl-ZeoR et avoir transformé la souche sauvage de M. Abscessus. Dans un dernier point nous nous somme intéressés à l'étude de coût conféré par ces mutations parraport à la croissance de M. Abscessus, phénomène assez fréquent chez les bactéries multi-résistantes à plusieurs antibiotiques. Nos résultats montrent que dans nos conditions expérimentales les mutations ne conféraient pas de « coût » à la croissance de la bactérie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai mis au point un procédé dans le système de mutagénèse utilisé pour la construction de mutants chez M. Abscessus (système de recombineering adapté pour M. Abscessus par Dr Medjahed Halima, et qui a fait l'objet de sa thèse), ce procédé permettait de s'affranchir des isolats spontanés rencontrés. Ces outils m'ont permis de construire un mutant du gène mmpL4b dans la souche isogénique M. Abscessus 390S. Ce gène joue potentiellement un rôle dans le transfert des glycopeptidolipides (GPL) vers la surface cellulaire de la bactérie, la souche mutante M. Abscessus AmmpL4b présente un phénotype rugueux, alors que la souche sauvage possède un phénotype lisse. La complémentation par le gène sauvage mmpL4b restaure le phénotype muqueux de la souche sauvage M. Abscessus 390S(S). Ensuite j'ai montré que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b perdait la faculté de se mouvoir par glissement sur milieu solide. Le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b ainsi que la souche complémentée ont été utilisées dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Dr Thomas F Byrd (New-Mexico, USA), cette équipe a montré que le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b était incapable de former des biofilmes contrairement à la souche sauvage et à la souche complémentée par le gène sauvage ΔmmpL4b. En outre, cette équipe a démontré le rôle des glycopeptidolipides (GPL) dans la virulence de M. Abscessus au niveau cellulaire. En effet, les résultats obtenus montrent que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b (qui produit un taux faible de GPL) pouvait se répliquer dans les macrophages et à stimuler le récepteur toll-like 2 des macrophages (TLR2), alors que les souches sauvage et complémentée n'activaient pas le récepteur TLR2 des macrophages.

  • Titre traduit

    Mycobacterium abscessus : contribution to the study of the cell envelope and the resistance to antibiotic


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    My thesis work was focused on the study of M. Abscessus resistance to aminoglycoside drugs, including kanamycin, amikacin gentamycin and streptomycin. In this study, we reported the presence of four mutations affecting the gene coding for the 16S rRNA (rrs) within a single rRNA operon, these mutations conferred drugs résistance to M. Abscessus. Besides the substitution A1408G (E. Coli numbering) found in earlier study i found three new substitutions T1406A, ; C1409T and G1491T conferring high level résistance to kanamycin, amikacin and gentamycin (MICs > 1000 ug/ml) but not to streptomycin. These mutations were shown to confer the same drugs résistance profil in clinical isolates of M. Tuberculosis (7). On the other hand, by complementing the different spontaneous mutants of M. Abscessus with wild-type rrs gene cloned into replicative plasmid pNBVl, l showed that these mutations are recessive compared to the wild type rrs gene. The absence of the three new mutations found in this study in clinical isolates of M. Abscessus, led us to consider their potential fitness cost. Our data showed that these mutations are no-cost (the mutations have no effect on the fitness of M. Abscessus) in our in-vitro competition System. This work lead to a publication submitted to Antimicrobial Agents and Chemotherapy journal this month. Another part of my project concerns the optimization of the recombineering System; this System was successfully used in M. Abscessus to generate mutants. However its low effkiency (7% of double cross over DCO) led us to develop a better System in order to improve the method. Three major phenomenons are responsible for the low level of the double cross-over (DCO) event in M. Abscessus : singles cross over (SCO), illegitimate recombination and the presence of spontaneous kanamycin resistant isolates. I have replaced the antibiotic résistance cassette kanamycin by zeocin (a Bleomycin family of antibiotic) in order to suppress the spontaneous background, in the linear construct used to make the homologous recombination; our System improved the method (15-20 % of double cross-over). In the final part of my project I have constructed by using the optimized recombineering System a mutant in mmpL4b gene in 390S isogenic strain of M. Abscessus and have complemented this M. Abscessus mmpL4b knock out strain by cloning the gene mmpL4b into replicative vector pNBVl and transforming the mutant strain with the construct pNBVl mmpL4b. The product of this gene is predicted to be involved in the transport of GPL to the cell surface. The mutant has rough phenotype (deprived from glycopeptidolipids (GPL) at the cell surface) the complemented strain has a smooth phenotype like the wild-type M. Abscessus 390S strain. I have shown that unlike the wild type and complemented strains, The mmpL4b deletion mutant lost sliding motility, demonstrating a role of the glycopeptidolipids in conferring motility. In collaboration with Dr Thomas F Byrd's group, we have shown that the M. Abscessus 390S mmpL4b knock out strain lost the ability to form biofilm. Importantly, the deletion mutant has regained the ability to replicate in macrophage and stimulate macrophage toll-like receptor 2. This study indicates that a single genetic change associated with loss of GPL is sufficient to convert M. Abscessus to a virulent phenotype. This study lead to a publication submitted this month to Microbiology Journal.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (168 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 281réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2010) 192
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 7795
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