Mécanismes moléculaires de l'initiation de la réplication

par Françoise Meisch

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire de la cellule

Sous la direction de Marie-Noëlle Prioleau.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Ma thèse a porté sur la régulation de l'initiation de la réplication chez les vertébrés. J'ai participé à l'identification et la caractérisation d'origines de réplication (ori) sur 1% du génome humain. Ces ori ont été identifiées dans des cellules HeLa grâce à la quantification de petits brins naissants, spécifiques de l'initiation de la réplication. Nous avons pu montrer qu'un lien fort existe entre les ori et les îlots CpG et que l'association des ori avec des marques de chromatine ouverte comme l'acétylation des histones n'est pas indispensable pour l'initiation. De plus, il n'y a pas de lien clair entre densité en ori et moment de réplication d'une région génomique donnée. Je me suis aussi intéressée à l'étape de licensing c. -à-d. La fixation au niveau des sites d'initiation potentiels du complexe de Pré-réplication (Pré-RC) avec en premier lieu ORC (Origin récognition complex). Le licensing s'effectue en phase Gl du cycle cellulaire et seuls les sites de fixation du Pré-RC peuvent être utilisés comme site d'initiation. Nous avons choisi de travailler avec la lignée aviaire DT40 qui effectue la recombinaison homologue à forte fréquence. J'ai donc construit des lignées qui expriment une protéine Orcl ou Orc2 étiquetée à partir du locus endogène. J'ai réalisé des immunoprécipitations de chromatine pour identifier leurs sites de fixation. Nous arrivons à avoir des enrichissements faibles mais cohérents de Orcl au niveau des ori connues du poulet. Comme les faibles enrichissements obtenus compliquent des approches plus globales, nous envisageons de répéter ces expériences sur des cellules en phase Gl, obtenues par élutriation, afin d'augmenter les enrichissements obtenus.

  • Titre traduit

    Molecular mechanisms of DNA replication initiation


  • Résumé

    My PhD focused on the molecular mechanisms governing initiation of DNA replication in vertebrates. I participated in the identification and characterization of origins of replication (ori) on 1% of the human genome. These ori have been identified in HeLa cells by quantification of short nascent strands, which are specific of replication initiation. We showed that a strong link exists between ori and CpG islands and that the association of ori with open chromatin marks like histone acetylation is dispensable for origin specification. Furthermore, no clear link emerges between ori density and the moment at which a genomic region replicates. I have also been interested in the licensing step which consists in the binding on the initiation sites of the Pre-replication complex (Pre-RC), in first place ORC (Origin recognition complex). Licensing takes place in the Gl phase of the cell cycle and only Pre-RC binding sites can be used as initiation sites. We chose to work with the avian DT40 cell line, able to perform homologous recombination at high frequency. I thus constructed cell lines which express tagged versions of the Orcl and Orc2 proteins and from the endogenous locus. I realized chromatin immunoprecipitations (ChIP) to identify their binding sites. We obtain small but coherent enrichments of Orcl at well known chicken ori. As these small enrichments complicate genome-wide approaches, we plan to repeat these experiments with elutriated cells in Gl phase in order to increase the ChIP enrichments.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 1 vol. (161 f.)
  • Annexes : 238 réf.

Où se trouve cette thèse\u00a0?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • Consultable sur place dans l'établissement demandeur
  • Cote : TS (2010) 172
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 7874
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.