Caractérisation du Système à Cinq-Composants GraSRX/VraFG impliqué dans la résistance aux peptides antimicrobiens et la virulence chez Staphylococcus aureus

par Mélanie Falord

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Tarek Msadek.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Staphylococcus aureus est un pathogène humain majeur, capable de provoquer des infections communautaires et nosocomiales dû a sa grande capacité d'adaptation. La transmission des signaux de l'environnement chez les bactéries implique souvent deux grandes familles de protéines fortement conservées : les ABC transporteurs, composés d'une perméase et d'une protéine de liaison à l'ATP, et les systèmes à deux composants, composés de couples d'histidine kinases, ou senseurs, généralement liées à la membrane, qui répondent à un stimulus environnemental spécifique, et phosphorylent leur régulateur de réponse partenaire, permettant son activation et l'expression de gènes cibles. Les peptides antimicrobiens tels que les défensines humaines (CAMPs) sont des composants clés de l'immunité innée, et des agents bactéricides efficaces, provoquant souvent la mort des bactéries par la formation de pores dans la membrane. S. Aureus peut résister aux CAMPs par plusieurs mécanismes, dont le principal implique une augmentation des charges positives à sa surface à travers la D-alanylation des acides téichoiques, et la lysylination des phospholipides, conduisant à une répulsion électrostatique des CAMPs. La synthèse des enzymes principales mises en jeu dans ces mécanismes (DltA, MprF) est régulée positivement par le système à deux composants GraS/GraR. Nous avons montré que ce système est mis en jeu dans la résistance aux Dermaseptines, et que la nature et la distribution des charges le long de ces peptides est importante pour la réponse GraSR-dépendante. Nous avons identifié une séquence palindromique de dix paires de bases (5'ACAAATTTGT 3') en amont des gènes contrôlés par GraR, requise pour la régulation transcriptionnelle par GraR et pour l'induction en présence de Colistine, un CAMP bactérien, suggérant que cette séquence est le site de fixation du régulateur GraR. Des prédictions d'analyses génomiques et une étude du transcriptome ont révélé plusieurs nouveaux membres du régulon GraR. Nous avons montrés que GraR est requis pour la croissance de S. Aureus à haute température et dévoilé des liens avec le système de quorum-sensing peptidique AgrC/AgrA contrôlant les gènes de virulence. Nous avons aussi montré que GraSR sont impliqués dans la réponse aux stress et contrôlent des voies de signalisation du métabolisme de la paroi. La kinase GraS fait partie d'une sous-famille spécifique désignée « kinase à détection intra-membranaire » avec une un domaine de détection amino-terminal court, et deux hélices transmembranaires séparées par une petite boucle de seulement cinq acides aminés. Les gènes graRS forment un operon avec le gène graX, de fonction inconnue. Nous avons mis en évidence un rôle essentiel de GraX et de l'ABC transporteur VraFG, codé par un operon situé en aval des gènes graXRS, dans la résistance aux CAMPs et montré qu'ils agissaient en détectant et en signalisant à travers la kinase GraS. Une approche d'analyse par la technique du double-hybride bactérien, conçue pour identifier des interactions entre GraS/GraR/GraX/VraF et VraG, nous a permis de montrer que GraS interagit à la fois avec GraX et la perméase VraG, indiquant l'existence d'un complexe multi-composants lié à la membrane et impliqué dans la détection et la signalisation en réponse aux CAMPs. Au cours de notre étude du système GraSR, nous avons découvert qu'un mutant dit A de S. Aureus produisait des quantités massives d'une matrice géante extracellulaire lors d'une croissance en présence de glucose. La souche sauvage est également capable de produire cette structure sous d'autres conditions nutritionnelles. Des résultats préliminaires indiquent que cette structure serait de nature protéique et liée à la D-alanylation ou a des niveaux réduits des acides téichoiques.

  • Titre traduit

    GraSRX/VraFG Five-Component System : characterization and Implication in Antimicrobial Peptides Resistance and Virulence in Staphylococcus aureus


  • Résumé

    Staphylococcus aureus, a major Gram-positive human pathogen, is a leading cause of both nosocomial and community infections due to its considerable capacity for adaptation. Bacterial environmental signal transduction pathways often involve two large families of highly conserved proteins: ABC transporters, composed of a membrane spanning domain protein and a nucleotide binding domain protein; and two-component Systems, coupled pairs of sensor histidine kinases, generally membrane bound, that respond to specific environmental stimuli to phosphorylate their cognate response regulator, which consequently regulates target gene expression. Cationic antimicrobial peptides (CAMPS) such as human defensins are key components of the innate immune defense. CAMPs are efficient antimicrobial agents, often killing bacteria through pore formation. S. Aureus is able to resist CAMPs through several mechanisms, chief among which is the increase of its positive cell surface charges through D-alanylation of teichoic acids and lysylination of phospholipids, leading to electrostatic repulsion of CAMPs. Synthesis of the major enzymes involved in thèse mechanisms (DltA, MprF) is positively controlled by the GraS/GraR two-component System. We showed that the GraSR System is involved in dermaseptin résistance and that charge distribution along the peptides is important for the GraSR-dependent response. We identified a highly conserved ten base pair palindromic sequence (5' ACAAA TTTGT 3') located upstream from GraR-regulated genes which we have shown to be essential for transcriptional regulation by GraR and induction in response to Colistin, a bacterial CAMP, suggesting it is the likely GraR binding site. Genome-based predictions and transcriptome analysis revealed several novel GraR target genes. We also found that the GraSR TCS is required for growth of S. Aureus at high temperatures and uncovered previously unsuspected links with the AgrC/AgrA peptide quorum sensing system controlling virulence gene expression. We also show that the GraSR are involved in stress reponse and controls cell wall metabolism signal transduction pathways. The GraS histidine kinase belongs to a specific subfamily designated « intramembrane sensing kinases», with a structure featuring a short amino-terminal sensing domain, with two transmembrane hélices separated by a short loop of only five amino acids. The graRS genes are part of a three-gene operon also containing graX, a gene of unknown function. We have shown that GraX and the VraFG ABC transporter, encoded by genes located downstream from the graXRS operon, are ail essential for CAMP résistance and act by sensing and signalling through GraS. A bacterial two-hybrid approach, designed to identify interactions between GraS/GraR/GraX/VraF and VraG, allowed us to show that GraS interacts with both GraX and the VraG permease, indicating the existence of a multicomponent membrane-linked signalling complex involved in CAMP sensing and signal transduction. During our study of the GraSR System, we discovered that a dltA mutant of S. Aureus produced massive amounts of a giant extracellular matrix when grown in the presence of glucose. The wild type strain is also capable of producing this structure albeit under different nutritional conditions. Preliminary results suggest this giant matrix is proteinaceous in nature and linked to D-alanylation or lowered amounts of teichoic acids.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (342 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 387 réf.

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  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2010) 171
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 7859
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