Etude de la régulation de la dynamique du pore de fusion : importance de la synaptobrevine 2 de la Rho GTPase Cdc42

Regulation of the dynamics of the fusion pore : importance of the SNARE protein synaptobrevin 2 and of the Rho GTPase Cdc42

• Auteur / Autrice : Marine Bretou
• Direction : François Darchen
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génomes et protéines
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exocytose

physiologie

Fusion membranaire

Protéines R-SNARE

embryologie

Protéines G rho

Électrophysiologie

Résumé

L'exocytose nécessite la formation d'un pore de fusion. Le pore initial est étroit ; seules de petites molécules sont libérées. Quand le pore s'élargit les macromolécules sont libérées. J'ai étudié le rôle de deux protéines sur la dilatation du pore: la protéine SNARE synaptobrévine 2 (Syb2), et la Rhô GTPase Cdc42. L'assemblage des SNAREs fournirait l'énergie nécessaire à la fusion. L'insertion d'un espacer dans le domaine juxtamembranaire de Syb2 ne modifie pas la fréquence des événements d'exocytose détectés par ampérométrie à 1|jM [Ca2+], mais empêche l'apparition d'une composante de sécrétion à de plus fortes [Ca2+]. Les événements peuvent être classés en deux groupes, liés à la vitesse et au degré de dilatation des pores; l'allongement de Syb2 réduit la population de pics rapides, mais n'affecte pas celle des pics lents. Les événements lents seraient dus à un assemblage partiel des SNAREs, alors que ceux dits rapides résulteraient d'un assemblage plus serré, assurant ainsi une dilatation rapide du pore. Cdc42 contrôle la dynamique de l'actine. Diminuer son expression dans les cellules BON réduit le nombre de granules fusionnant complètement avec la membrane, mais n'affecte pas leur recrutement et leur liaison à la membrane. Réduire l'expression de Cdc42 diminue le nombre de hauts pics dus à une dilatation rapide et complète des pores, et augmente le nombre de pieds seuls, dus à des pores ne s'élargissant pas. L'augmentation de tension de la membrane corrige les effets dus à l'absence de Cdc42 ; sa diminution par dépolymérisation de l'actine imite les effets obtenus en son absence. Cdc42 contrôlerait la dilatation du pore en modulant la tension de membrane.

Exocytosis ends with the formation of a fusion pore. The initial pore is narrow, only small molecules flow through it. The pore then enlarges, releasing larger secretory products. I studied the role of two proteins on the dilation of the pore: the SNARE protein synaptobrevin 2 (Syb2), and the Rho GTPase Cdc42. Zippering of SNAREs in opposed membranes might give energy to catalyze fusion. Inserting a linker between the SNARE core and the transmembrane domain of Syb2 did not modify the frequency of exocytotic events detected by amperometry at 1|jM free [Ca2+] but prevented the occurrence of an extra component of release at higher [Ca2+]. Analysis of these events led to their classification into two groups, due to the rate and extent of dilation of the pore; lengthening Syb2 reduced the population of fast spikes, leaving the slow one unchanged. Slow fusion events might be due to a partial zippering of the SNAREpin while fast fusion events require a tight one, i. E. A short intermembrane distance to assure rapid dilation of the pore. Cdc42 controls actin dynamics. TIRFM experiments showed that its silencing in BON cells reduced the number of granules undergoing full fusion, with little effect on their recruitment and docking at the membrane. Using amperometry, we showed that this silencing reduced the number of high spikes due to fast and complete dilation of the pore, and increased stand-alone foot signals reflecting pores failing to enlarge. Increasing membrane tension rescued the effects of silencing while decreasing it through actin depolymerization mimicked Cdc42 silencing. Cdc42 might control fusion pore dilation by modulating membrane tension.