Etude de la relation structure-fonction des RNases J chez B. Subtilis et du chloroplaste de Chlamydomonas rheinhardtii

par Ailar Jamalli

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Harald Putzer et de Francis-André Wollman.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Les mécanismes de la maturation et de la dégradation de TARN sont très différents chez Escherichia coli et les bactéries à Gram-positif. Cette observation se reflète daiis leurs jeux de RNases qui sont différents. Chez B. Subtilis, un acteur majeur impliqué dans ces événements est l'endoribonucléase RNase J qui est une protéine essentielle, qui possède également une activité 5'-3' exonucléolytique. La RNase J n'a aucune similarité de séquence avec la RNase E, qui à un rôle essentiel dans la dégradation des ARNm chez E. Coli. Néanmoins, ces deux enzyme peuvent cliver au même endroit dans la région leader de l'ARNm du gène thrS de B. Subtilis. Les deux enzymes montrent aussi une sensibilité à l'état de phosphorylation de l'extrémité 5' de leur substrat, mais ceci est lié à l'activité 5'->3' exonucléolytique dans le cas de la RNase J et à une stimulation de l'activité endonucléolytique dans le cas de la RNase E. Nous avons voulu déterminer la base structurale de la double activité de la RNase J et avons réussi à déterminer la structure 3D de la RKa'se J seule et en complexe avec une molécule UMP. Cela nous a permis d'identifier une poche de liaison aux nucléotides 5' monophosphorylés qui se trouve très proche du centre catalytique donnant un aperçu de la façon dont la RNase J peut reconnaître un substrat 5'-monophosphorylé et le dégrader par voie exonucléolytique, tout en discriminant contre des transcrits originaux portant une extrémité 5'- PPP. Nous avons montré que cette dépendance est stricte et qu'un substrat 5' triphosphorylé ne peut pas être dégradé par la voie exonucléotique. Nos données structurales et biochimiques indiquent comment les deux activités de la RNase J peuvent être accomplies par un seul centre catalytique et suggèrent que la RNase J pourrait changer rapidement d'un mode endo-exonucléolytique sur un même ARN. Cette propriété aurait d'importantes implications pour le métabolisme de TARN chez de nombreux organismes procaryotes et les organelles de plantes qui contiennent des orthologues de la RNase J. Par ailleurs, la RNase J montre des similarités structurales inattendues avec la partie catalytique de la RNase E. Nous avons analysé également l'importance de cette observation en échangeant des domaines entre les deux enzyme et en mesurant l'activité de ces protéines hybrides, ce que nous a permis de construire deux chimère. Et parmi céslleux il y en a une qui est actif et l'autre qui est inactif. Nous avons aussi cherché la régulation de la RNase Jl de B. Subtilis, ce que nous a permis de comprendre la autorégulation et cross régulation de cette enzyme par RNase J2.

  • Titre traduit

    Study of structure-function relationship of RNase J in B. Subtilis and chloroplast of Chlamydomonas rheinhardtii


  • Résumé

    The mechanisms of RNA processing and degradation are markedly different between Escherichia coli and Gram- positive organisms. This observation is reflected in their quite different sets of RNases. In B. Subtilis, a potential key player in these events is the essential endoribonuclease RNase J, which has recently been shown to possess also a 5'-3' exonucleolytic activity. RNase J shares no amino acid similarity with RNase E, which has a central role in mRNA degradation in E. Coli. Nevertheless, both enzymes can cleave at the same site in the leader region of the B. Subtilis thrS mRNA and both show sensitivity to the phosphorylation state of the 5'-end of the mRNA. However, this sensitivity is linked to its 5'-3' exonucleolytic activity of RNase J while it is the endonucleolytic activity that is stimulated in the case of RNase E. We set out to determine the structural basis for the dual activity of RNase J and succeeded in resolving the 3D structure of free RNase J and a UMP-RNase J complex. This allowed us to identify a nucleotide 5'-P binding pocket near the catalytic center providing insight into how RNase J can recognize and exonucleolytically attack a 5'monophosphorylated transcript while discriminating against initial 5'-PPP transcripts. We show that this dependence is strict; an initial 5'-PPP transcript cannot be degraded exonucleolytically from the 5'-end. Our structural and biochemical data indicate how both activities of RNase J can be carried out by a single active site and suggest that RNase J might switch promptly from endo- to exonucleolytic mode on the same RNA, a property that has important implications for RNA metabolism in numerous prokaryotic organisms and plant organelles containing RNase J orthologs. Moreover, RNase J shows unexpected structural similarities with the catalytic part of RNase E. We also analyzed the importance of this observation by exchanging domains between the two enzymes and measuring the activity of these proteins hybride, which allowed us to construct two chimeric. And among these two there is one that is active and the other is inactive. We also examined the regulation of RNase Jl of B. Subtilis, which has enabled us to understand the self-and cross-regulation of this enzyme by RNase J2.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (155 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 165 réf.

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  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2010) 153
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 7774
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