La multi-ligation triazole : développement de nouveaux outils pour la synthèse de mimes de protéines par cycloadditions successives

par Ibai Valverde

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Agnès Delmas.

Soutenue le 14-04-2010

à Orléans , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences et technologies (Orléans) , en partenariat avec Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-) (laboratoire) .

Le président du jury était Luigi Agrofoglio.

Le jury était composé de Agnès Delmas, Luigi Agrofoglio, David Crich, Gilles Guichard, Vincent Aucagne, Nicolas Inguimbert.

Les rapporteurs étaient David Crich, Gilles Guichard.


  • Résumé

    Ce travail est consacré au développement d’une nouvelle méthode de synthèse d’analogues bioactifs de protéinesen utilisant des réactions successives de cycloaddition entre les alcynes terminaux et les azotures (CuAAC).Pour pouvoir effectuer des cycloadditions itératives, nous avons étudié la stabilité et les conditions de coupure dedifférents groupements masquants des alcynes terminaux. Cette étude a été valorisée par le développement d’unestratégie originale pour réaliser un triple cycloaddition successive une même molécule basée sur la protectiontemporaire de la fonction alcyne.La méthode a été appliquée à la synthèse d'un analogue de la stéfine A humaine, un inhibiteur naturel deprotéases à cystéine d’intérêt thérapeutique. Pour cela, nous avons mis au point des conditions de CuAACsuccessive compatibles avec des peptides déprotégés de façon beaucoup à obtenir in fine un analogue bis-triazolede la stéfine A. Les études par dichroïsme circulaire et d’inhibition de diverses protéases à cystéines confirmentque notre analogue synthétique conserve la structure et l’activité biologique de la protéine native.La stratégie de ligation triazole successive a été étendue par la mise au point de conditions pour réaliser desligations sur phase solide. La méthodologie développée permet la synthèse de protéines de façon plus rapide etplus simple que par des procédés classiques de ligation successive en solution. Dans l’optique de la synthèse destructures glycopeptidiques capables d’induire une réponse immunitaire contre MUC1 tumorale, nous avons réaliséla synthèse d’analogues peptidiques de MUC1 par ligation successive sur phase solide de 160 acides aminés.

  • Titre traduit

    Triazole multi-ligation : development of new tools for the synthesis of protein analogues through sucessive cycloadditions


  • Résumé

    The aim of this work was the development of a novel method for the synthesis of triazolo-proteins by multiplesuccessive copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions (CuAAC).In order to achieve several successive cycloadditions, we have studied the stability and cleavage conditions ofseveral alkyne protective groups. This study leaded us to the development of an original strategy in order toachieve three successive cycloadditions on a same scaffold by temporal protection of alkyne functionalities.The method has been applied to the synthesis of an analogue of human stefin A, a natural inhibitor of severaltherapeutically relevant cysteine proteases. Therefore, we have developed CuAAC conditions compatible withunprotected peptide ligation. The strategy allowed us to obtain a bis-triazolo analogue of human stefin A. Circulardichroism and enzymology assays on several cysteine cathepsins revealed that the synthetic analogue hasretained the folding and full biological activity of the native protein.In order to expand the possibilities of this strategy, we have developed reaction conditions allowing us to performsuccessive triazole ligation on solid phase. This methodology avoids the need for a time-consuming and laborintensivepurification step before and after each ligation. With the aim of exploring the use of analogues of thetumor-associated form of the glycoprotein MUC1 to induce a specific immune response, we have synthesized atriazolo-analogue of MUC1 of 160 aminoacids using solid phase peptide ligation.

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