Mesure des effets isotopiques cinétiques lors de la dégradation d’alcaloïdes tropaniques par les souches de bactéries Pseudomonas AT3 et MS2

par Katarzyna Kosieradzka

Thèse de doctorat en Chimie analytique

Sous la direction de Richard Robins et de Emmanuel Gentil.


  • Résumé

    Measurement of kinetic isotope effects during the degradation of tropane alkaloids by the bacterium Pseudomonas strains AT3 and MS2 During the use of the tropane alkaloids nortropine and norpseudotropine as substrates for growth by the bacterium Pseudomonas AT3, a C–N bond is ruptured. With the objective of elucidating the mechanism of this reaction, the isotope fractionations in 15N/14N at natural abundance and in 2H/1H in appropriately specifically enriched substrates were measured. These data can be used to calculate the kinetic isotope effects (KIEs). For this, it was necessary to develop a protocol to extract the metabolites from the growth medium and quantify them precisely, so as to assess the extent of advancement of the reaction. This was achieved using a derivatisation procedure that rendered the alkaloids both less water soluble and more amenable to analysis by GC. The isotope ratios in 15N/14N were determined by isotope ratio mass spectrometry, which requires a precision of below 0. 5‰. In order to ensure the reliability of the isotope KIEs obtained, it was necessary to define the metabolic relationship between nortropine and norpseudotropine. It was shown that nortropine is significantly transformed into norpseudotropine (approx. 20%), although the reverse occurs to a much lesser extent (<10%). This study exploited several approaches: the use of compounds enriched in 2H; 15N at natural abundance; the properties of the enzymes involved. A weak and inverse KIE in 15N was obtained, although no KIE in 2H was detected. These data enable a model for the rupture of the C–N bond to be put forward, which is in agreement with the values for the KIEs obtained by theoretical calculation

  • Titre traduit

    Measurement of kinetic isotope effects during the degradation of tropane alkaloids by the bacterium Pseudomonas strains AT3 and MS2


  • Résumé

    Lors de l’utilisation des alcaloïdes tropaniques nortropine et norpseudotropine comme substrats de croissance par des bactéries Pseudomonas AT3, une liaison C–N est rompue. Dans le but d’élucider le mécanisme de cette réaction, les fractionnements isotopiques en 15N/14N en abondance naturelle et en 2H/1H des composés spécifiquement marqués ont été mesurés, données qui permettent le calcul des effets isotopiques (EICs). Réaliser cette démarche a exigé le développement d’un protocole analytique qui a permis d’extraire du milieu bactérien les métabolites et de les quantifier précisément, afin de calculer le facteur d’avancement de la réaction. Ce but a été atteint grâce au développement d’une méthode de dérivation dont le double objectif est de rendre les composés moins soluble dans l’eau et plus adaptés aux exigences d’une analyse par CG. Les rapports isotopiques en 15N/14N ont été mesurés par spectrométrie de masse de rapports isotopiques qui demande une précision de moins de 0,5‰. Afin de s’assurer de la fiabilité des EICs mesurés, il faut tout d’abord bien définir les rôles respectifs de la nortropine et de la norpseudotropine dans le métabolisme. Il a été montré que la nortropine est significativement transformée en norpseudotropine (~20%) malgré que l’inverse soit moins important (<10%). Cette étude a exploité plusieurs approches : les composés enrichis en 2H ; l’étude en 15N en abondance naturelle ; les propriétés des enzymes impliquées. Un EIC-15N faible et inverse a été obtenu mais aucun EIC en 2H n’a été trouvé. Ces renseignements nous ont permis de proposer un modèle de mécanisme de rupture de la liaison C–N en accord avec les valeurs d’EIC obtenues par calcul théorique

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Informations

  • Détails : 1 vol. (194 f.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 168-174.

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