Nouveaux outils pour l'évaluation de la biodégradabilité des composés pétroliers

par Marc Auffret

Thèse de doctorat en Microbiologie environnementale

Sous la direction de Gérald Thouand.

Soutenue en 2010

à Nantes , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers , en partenariat avec Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques (autre partenaire) .


  • Résumé

    La présence dans l’environnement de composés pétroliers ou d’additifs des essences ou des gazoles, pose de graves problèmes en raison de leur toxicité et/ou de leur persistance. La directive européenne REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) a mis en place une évaluation de ces critères pour les composés chimiques utilisés et produits par l'industrie. En particulier, la persistance des composés dans l'environnement est estimée par leur biodégradabilité qui est déterminée par des tests physiologiques standardisés. Ceux-ci ne sont pas adaptés à l’étude de mélanges complexes de produits comme c'est le cas, entre autres, pour les carburants. Des outils biomoléculaires (Biopuces à ADN) pourraient constituer une réponse adaptée à ce problème. L'objectif de la recherche était de valider une méthodologie permettant de créer une Biopuce à ADN destinée à l'évaluation des capacités de biodégradation des carburants et de leurs additifs. Dans ce but, nous avons déterminé les capacités de dégradation de divers échantillons environnementaux (boue activée, sol pollué de station-service ou sol de forêt non pollué) envers plusieurs composants des essences ou des gazoles par des tests de minéralisation classiques. À partir de ces échantillons, nous avons obtenu par enrichissement sur un mélange de 16 composés, un consortium (Mix 3) et avons montré sa capacité à dégrader 15 des composés fournis dans le mélange (n-alcanes, BTEXs, naphtalène, MTBE, ETBE, cyclohexane, cyclohexanol, 2-EHN). Nous avons étudié la diversité phylogénétique du consortium Mix 3 par DGGE. Nous avons isolé 15 des microorganismes présents dans Mix 3 et certains ont montré des capacités de dégradation intéressantes vis-à-vis des 16 composés étudiés. Plus particulièrement, Rhodococcus wratislaviensis dégrade 11 des composés et Rhodococcus aetherivorans peut dégrader l'ETBE et le MTBE. Nous avons étudié chez ces 2 microorganismes les effets de synergie ou d'inhibition entre les différents composés. La présence du gène ethB codant pour un cytochrome P450 impliqué dans la dégradation de l'ETBE a été détectée chez R. Aetherivorans et son rôle dans la dégradation montré par RT-PCR. Une méthodologie de création d'une puce à ADN a été mise au point en utilisant les ADNc synthétisés à partir des ARNm induits chez R. Aetherivorans en présence d'ETBE. Cette puce a permis de mettre en évidence l'induction du gène ethB. Après cette étape de validation, nous avons pu mettre en évidence, grâce à des biopuces réalisées avec R. Wratislaviensis ou R. Aetherivorans, l'expression de gènes dans des cas où les voies de dégradation et les gènes cataboliques n'étaient pas connus : prmA (propane monooxygénase) dans la dégradation de l’hexadécane, un cytochrome P450 dans la dégradation du toluène et IpbD (2-hydroxy-6-oxo-7-methylocta-2,4-dienoate hydrolase) dans la dégradation du cyclohexane. Le prototype de biopuce qui a été développé pour l’étude spatio-temporelle de l’expression génique bactérienne dans des environnements naturels, serait un outil puissant pour caractériser chez les microflores indigènes, la capacité de dégradation potentiel de polluants.

  • Titre traduit

    New tools to evaluate thebiodegradability of petroleum compounds


  • Résumé

    The presence in the environment of petroleum compounds (gasoline, diesel oil and their additives) is a great concern due to their toxicity and/or persistence. REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) is a new European regulation concerning chemicals used or produced by industry. It’s purpose is to evaluate chemicals for these two criteria. In particular, the persistence in the environment of chemicals can be estimated by measuring their biodegradability, which is currently carried out via standardized physiological tests. Nevertheless, such physiological tests are not appropriate in several cases, for example when it comes to estimating the biodegradability of mixtures of chemicals such as those in petroleum products. In this case, molecular tools, including DNA microarrays, may provide useful answers to this problem. The objective of this research was to develop a method for producing DNA microarrays to evaluate the biodegradation potential of petroleum hydrocarbons or some oil and diesel additives. In this regard, we evaluated the degradation capacities of various environmental samples (activated sludge, soil from a polluted gas station, pristine forest soil) towards several compounds of gasoline and diesel oil. A bacterial consortium (Mix 3) was enriched from these different environmental samples on a mixture of 16 compounds. It had the capacity to degrade 15 compounds in the mixture (n-alcanes, BTEXs, naphtalene, MTBE, ETBE, cyclohexane, cyclohexanol, 2-EHN) and we studied its phylogenetic diversity by DGGE. Fifteen different microorganisms were isolated from Mix 3 and some of them had interesting degradation capacities towards the 16 compounds. More specifically, Rhodococcus wratislaviensis degraded 11 of the compounds and Rhodococcus aetherivorans degraded ETBE and MTBE. For these 2 strains, we studied the synergistic and inhibitory effects when the compounds were provided as mixtures. The ethB gene encoding a cytochrome P450 involved in ETBE biodegradation was identified in R. Aetherivorans and its role towards ETBE was demonstrated by RT-PCR. The method for producing a DNA microarray was based on the cDNA synthethized from the mRNA induced in R. Aetherivorans during its growth on ETBE. This microarray enabled us to show the specific induction of ethB, thus proving the potential of the developed methodology. Following this validation step, other microarrays based on the genes induced in R. Wratislaviensis or R. Aetherivorans were constructed and we demonstrated the induction of new genes in cases where the biodegradation pathways as well as the catabolic genes involved had not been previously characterized: the prmA gene (propane monooxygenase) expressed during hexadecane degradation, a cytochrome P450 expressed during toluene degradation and IpbD (2-hydroxy-6-oxo-7-methylocta-2,4- dienoate hydrolase) expressed during cyclohexane degradation. The prototype microarray that was developed to assess bacterial gene expression in natural environments over space and time will provide a valuable tool for characterizing the pollutant potential degradation capacity of indigenous microflora.

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  • Détails : 1 vol. (246 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 225-244

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