Caractérisation par microscopie électronique des étapes précoces de l'entrée du virus de l'hépatite C dans les hépatocytes

par Marie Perrault

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Eve-Isabelle Pécheur et de Florence Ruggiero.

Le président du jury était Patrice André.

Le jury était composé de Olivier Lambert, François-Loïc Cosset.

Les rapporteurs étaient Jean Dubuisson, Philippe Roingeard, Peter Bruckner.


  • Résumé

    L'infection par le virus de l'hépatite C (HCV) reste aujourd'hui une cause majeure d'hépatite chronique, de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. L'attachement cellulaire et l'entrée de HCV sont médiés par les protéines d'enveloppe E1 et E2. De nouveaux récepteurs ont été récemment identifiés mais l'entrée du virus dans les hépatocytes reste énigmatique et n'a jamais été visualisée. Nous avons tout d'abord caractérisé le modèle des pseudo-particules HCV (HCVpp) encryomicroscopie électronique en transmission (cryo-MET). Ce sont des particules sphériques de 100 nm de diamètre portant à leur surface E1 et E2. Nous avons ensuite visualisé l'entrée des HCVpp dans les hépatocytes en MET conventionnelle en utilisant des lignées d'hépatome et des hépatocytes primaires humains(PHH). Ces derniers maintiennent leur polarité en culture comme en témoigne la persistance de canalicules biliaires, tels que dans les hépatocytes natifs. Après synchronisation à 4°C avec les cellules, les HCVpp sont retrouvées liées aux prolongements cellulaires via des 'piliers', et sont ensuite internalisées à 37°C par endocytose dépendante de la clathrine. Ces 'piliers', actuellement en cours d'identification par immunomarquages, sont internalisés avec les HCVpp dans les hépatocytes au sein de vésicules de clathrine ; ce suivi est effectué par des approches de congélation haute pression et de tomographie électronique. Enfin, les évènements d'endocytose des HCVpp dans les PHH se sont avérés rares, avec une cinétique ralentie comparée aux lignées cellulaires. Ces études en MET soulignent l'importance d'utiliser un modèle cellulaire physiologique polarisé pour l'étude du mécanisme d'entrée de HCV.

  • Titre traduit

    Unraveling the details of the entry of hepatitis C virus into hepatocytic cells by electron microscopy imaging


  • Résumé

    Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Receptor recognition, cell binding and membrane fusion rely on HCV envelope proteins E1 and E2. New receptors were recently discovered; however HCV entry into hepatocytes remains largely unknown and has not yet been visualized. At first, we characterized HCV pseudoparticles (HCVpp) by cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM). They appeared as regular spherical structures of ca. 100-nm, with E1 and E2 at their surface. By conventional TEM, we then visualized HCVpp entry into hepatocytes, using hepatoma cells and primary human hepatocytes (PHH) as a more physiological cell model.PHH maintain their polarity in culture as attested by TEM observation of persistent bile canaliculi. At 4°C, viral particles were primarily found attached to microvilli at the cell surface via molecular bridges and, after warming to 37°C, they were internalized by endocytosis in clathrin-coated pits and vesicles. Using freeze substitution and electron tomographyapproaches, these bridges were found intimately surrounding HCVpp inside the clathrincoated vesicles, suggesting a concomitant internalization. The nature of these bridges is currently under investigation by immunogoldlabeling approaches. Finally, we reproducibly observed less HCVpp internalization events in PHH compared to hepatoma cells, and the kinetics of these events seemed delayed, probably due to PHH polarity. To conclude, ourTEM approach proved powerful to visualize HCV entry, and highlights the importance of studying a physiological cell model to understand HCV entry mechanism.

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