Analyse des réponses cellulaires induites par l’intégration d’un ADN étranger au sein du génome

par Virginie Gay

Thèse de doctorat en Virologie

Sous la direction de Corinne Ronfort et de Karen Moreau.

Soutenue le 22-10-2010

à Lyon 1 , dans le cadre de École Doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation , en partenariat avec Rétrovirus et pathologie comparée : équipe de recherches en Biologie Humaine (équipe de recherche) et de Rétrovirus et pathologie comparée (laboratoire) .

Le président du jury était Dominique Le Guellec.

Le jury était composé de Chang X. Zhang.

Les rapporteurs étaient Jean-François Mouscadet, Luc Willems, Stéphane Emiliani.


  • Résumé

    Il existe un certain nombre de situations au cours desquelles l’intégrité du génome cellulaire est mise en danger. Ceci se produit notamment lors de mouvements de gènes (translocation, éléments mobiles), lors d’infections virales parfois intégratives (AAV, HBV, HPV) ou lors d’infections rétrovirales. En effet, le cycle de réplication des rétrovirus nécessite une étape d’intégration du génome viral dans l’ADN génomique de la cellule infectée. Malgré les nombreuses études menées sur les infections par le VIH, les cancers viro-induits ou non et les thérapies géniques basées sur les rétrovirus, aucune donnée n’est actuellement disponible sur les modifications cellulaires induites par de telles perturbations chromosomiques. L’objectif du projet était d’identifier des mécanismes cellulaires induits par des atteintes à l’intégrité du génome, plus précisément par l’insertion de molécules d’ADN non cellulaire dans les chromosomes. L’intégration de matériel génétique additionnel a été induite par des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1. Les modifications cellulaires uniquement dues à l’intégration ont été isolées par comparaison de vecteurs intégratif et non intégratif. Des cellules primaires du derme humain ont été sélectionnées pour l’étude. Les temps post infection et les doses virales les plus adéquates ont été sélectionnés grâce à des expériences de cinétiques d’intégration couplées à une quantification des ADN viraux intégrés. L’analyse des modifications cellulaires induites par l’intégration de l’ADN étranger a portée sur l’ensemble du transcriptome et sur l’ensemble du protéome cellulaire. Dans le but d’effectuer une analyse transcriptomique, des puces à ADN, représentant le génome humain complet, ont été utilisées. Cette étude a démontré une forte répression transcriptionnelle induite par l’intégration. De plus, toutes les fonctions cellulaires sont perturbées par le processus. Finalement, une classification par interactions et fonctions biologiques a mis en évidence cinq processus cellulaires majoritairement affectés par l’intégration de l’ADN étranger, qui correspondent au cycle et à la mort cellulaire, au remodelage et à la réparation de la chromatine et à la réponse immunitaire ou au stress. Dans le but de compléter cette analyse transcriptomique, une étude protéomique a été réalisée. Les protéines cellulaires ont été séparées sur des gels bi-dimensionnels. Parmi les neuf protéines identifiées en spectrométrie de masse, certaines appartiennent au cytosquelette et d’autres aux mécanismes de réponse au stress. L’intégration d’un ADN étranger au sein du génome provoque donc bien des perturbations cellulaires. L’intégration de matériel génétique additionnel ne concernant pas seulement les rétrovirus, les données obtenues lors de cette étude pourront permettre (i) de développer des stratégies de défenses contre les rétrovirus ou contre les autres maladies caractérisées par des atteintes à l’intégrité du génome, (ii) d’évaluer les risques encourus par l’intégration d’un vecteur thérapeutique dans le génome cellulaire lors des thérapies géniques ou des expériences de transfert de gènes

  • Titre traduit

    Analyses of cellular responses induced by a foreign DNA integration into the genome


  • Résumé

    In numerous situations, cell genome integrity could be in danger. This is the case during gene movements (translocations, mobiles elements), during viral infections that could be sometimes integrative (AAV, HBV, HPV) or during retroviral infections. Indeed, the replication cycle of retroviruses requires a viral genome integration step. In spite of the studies on HIV infections, viral or non viral cancers and retrovirus-based gene therapy, no data are available concerning the cellular modifications induced by such chromosomal disruptions. The aim of work was to identify cellular mechanisms induced by the insertion of a non cellular DNA into the chromosomes. The integration of additional DNA was provoked by HIV-1-based lentiviral vectors. Cellular modifications only due to the integration step were isolated by comparison of integrative and non integrative vectors. Primary human dermal fibroblasts cells were selected for the study. Optimal times post infection and viral quantities were defined using kinetic integration experiments and integrated viral DNA quantifications. The study of cellular modifications induced by the integration of the foreign DNA was applied on the cellular global transcriptome and proteome. In order to perform a transcriptomic analyses, DNA microarray corresponding to the whole human genome, were used. This study revealed a strong transcriptional repression induced by the integration. Moreover, every cellular function are disturbed by the process. Finally, a network based on molecular interactions and biological functions underlined five cellular processes mostly affected by the foreign DNA integration and corresponding to the cell cycle and death, the remodelling and repair of chromatin and the immunity or stress responses. To complete this transcriptomic analyses, a proteomic study was realized. Cellular proteins were separated on 2D gels. Among the nine proteins identified by mass spectrometry, some are linked to the cytoskeleton and other to the cellular stress. Thus, integration of a foreign DNA into the genome provoked cellular perturbations. As additional DNA integration do not only concern retroviruses, data obtained during this study could allow (i) the development of defensive strategies against retroviruses or other diseases implicating the genome integrity and (ii) the evaluation of risks linked to the integration of a therapeutic vector into the genome during gene therapy and gene transfer experiments


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