Identification, évolution et mort cellulaire chez un groupe de protistes, les Parabasalia

par Clea Mantini

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Eric Viscogliosi.

Soutenue le 19-10-2010

à Lille 2 , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé (Lille) .


  • Résumé

    Les Parabasalia constituent un groupe d’eucaryotes unicellulaires répartis en 2 classes : les hypermastigines et les trichomonadines. Le premier volet de ma thèse concerne l’étude de la systématique de ce groupe par l’utilisation d’outils moléculaires. En séquençant les gènes codant pour différents marqueurs de nombreux taxons d’intérêt, des phylogénies moléculaires sont construites et comparées à la systématique traditionnelle basée sur un nombre limité de caractères morphologiques. Ces phylogénies moléculaires sont largement en conflit avec la classification actuelle et appelle donc à une révision globale de la taxonomie de ce groupe. Le second volet de mes travaux concerne l’étude des processus de mort cellulaire chez la trichomonadine, Trichomonas vaginalis, l’agent responsable de la trichomonose humaine qui est la maladie transmise sexuellement d’origine non virale la plus répandue à travers le monde. Il est possible d’induire une forme de mort cellulaire distincte de la nécrose chez ce parasite via l’utilisation de drogues pro-apoptotiques comme la staurosporine. Certaines caractéristiques de cette mort cellulaire sont communes à celles observées pour l’apoptose des métazoaires alors que d’autres semblent spécifiques à ce parasite. Ce microorganisme présente en outre deux particularités intéressantes dans le cadre de notre projet. La première est son unicellularité. En effet, on sait aujourd’hui que l’apparition des mécanismes de mort cellulaire a précédé celle de la multicellularité. De ce fait, étudier ces processus de mort cellulaire chez les unicellulaires peut apporter des informations intéressantes sur un problème de biologie générale qui est l’origine de la mort cellulaire chez les métazoaires. La seconde est qu’il est dépourvu de mitochondries et de ce fait pouvoir induire une mort cellulaire chez Trichomonas pourrait remettre en question le rôle central de la mitochondrie dans le processus apoptotique. Nous avons donc initié l’identification et la caractérisation des molécules potentiellement impliquées dans la mort cellulaire chez ce microorganisme. Une recherche in silico menée dans le programme de séquençage du génome de T. vaginalis ne nous a pas permis d’identifier de protéines homologues à celles connues comme étant impliquées dans le processus d’apoptose chez les métazoaires à l’exception de possibles métacaspases qui sont considérées comme des caspases primitives. Ces protéines, au nombre de 11 chez Trichomonas, possèdent toutes le domaine catalytique peptidase C14 et la dyade histidine-cystéine du site catalytique caractéristiques des caspases. Ces métacaspases de Trichomonas peuvent se regrouper en deux classes : l’une englobant celles présentant une extension amino-terminale et l’autre regroupant celles ne présentant pas cette extension. Dans un premier temps, nous avons étudié l’expression relative des 11 gènes codant ces métacaspases par PCR quantitative après induction de l’apoptose par la staurosporine. Nous avons montré une surexpression significative de la plupart de ces gènes. Cette régulation est donc différente de celle généralement observée pour les gènes de caspases. Nous avons ensuite mené une étude biochimique et enzymatique pour un représentant de chacune des deux classes de métacaspases de Trichomonas. Après production de ces protéines en système bactérien, nous avons montré, par western blot, qu’elles ont la propriété de s’autocliver tout comme les métacaspases étudiées chez d’autres organismes et les caspases initiatrices des métazoaires. Ces résultats ont été confirmés par la production de ces deux métacaspases mutées au niveau des deux résidus C et H du site catalytique. De plus, l’étude de l’activité enzymatique de ces protéines révèle une forte spécificité endopeptidase arginine ou lysine spécifique comme pour les autres métacaspases décrites jusqu’à présent et donc différente de celle des caspases qui est aspartate spécifique. [...]

  • Titre traduit

    Identification, evolution and cellular death in a protist group, the Parabasalia


  • Résumé

    The Parabasalia are a group of unicellular eukaryotes divided into two classes: hypermastigines and trichomonadines. The first part of my thesis is the study of this group’s systematic by using molecular tools. By sequencing the genes coding for different markers of interest in many taxa, molecular studies are constructed and compared with traditional systematics based on a limited number of morphological characters. These molecular phylogenies are largely in conflict with the current classification and therefore it’s necessary to do a revision of this group’s taxonomy. The second part of my work concerns the study of cell death of one trichomonads, Trichomonas vaginalis. It’s the causative agent of human trichomoniasis which is a sexually transmitted disease of nonviral origin most common worldwide. It is possible to induce a form of cell death distinct from necrosis in the parasite through the use of pro-apoptotic drugs such as staurosporine. Some features of this cell death are common to those observed for metazoan apoptosis, while others seem specific to this parasite. This organism also has two interesting features in the context of our project. One is his unicellularity. In fact, now we know that the apparition of the cell death mechanism preceded that of multicellularity. Therefore, the study of these cell death processes in unicellular organisms can provide valuable information on a general biology problem , the cell death origin in metazoans. The second is that T. vaginalis is devoid of mitochondria and thus can induce cell death in trichomonads could answer the question of the central role of mitochondria in apoptosis. We have therefore initiated the identification and characterization of molecules potentially involved in cell death in this organism. An in silico research conducted in the program to sequence the genome of T. vaginalis does not allow us to identify proteins homologous to those known to be involved in the process of apoptosis in metazoans except metacaspase possible that caspases are considered primitive. These proteins, numbering 11 in Trichomonas, possess all the catalytic domain Peptidase C14 dyad histidine-cysteine catalytic site characteristics of caspases. These metacaspase Trichomonas can be grouped into two classes: one comprising those having an amino-terminal extension and the other comprising those that do not have this extension. Initially, we studied the relative expression of 11 genes encoding these metacaspase Quantitative PCR after induction of apoptosis by staurosporine. We showed a significant overexpression of most of these genes. This regulation is therefore different from that generally observed for genes of caspases. We then conducted a biochemical and enzyme for one representative of each of the two classes of Trichomonas metacaspase. After producing these proteins in bacterial system, we showed by Western blot, they have the property of autocliver like metacaspase studied in other organisms and metazoan initiator caspases. These results were confirmed by the production of these two metacaspase mutated at both C and H residues of the catalytic site. In addition, the study of the enzymatic activity of these proteins reveals a high specificity endopeptidase specific arginine or lysine as for other metacaspase described so far and therefore different from that of caspases is specific aspartate. that of caspases. Finally, we construct a subtractive library to identify other proteins potentially involved in cell death in this protozoan.[...]


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