Oligomérisation des récepteurs à la leptine

par Johan Bacart

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Philippe Froguel.

Soutenue en 2010

à Lille 2 .


  • Résumé

    La leptine, une hormone sécrétée par le tissu adipeux, est responsable du phénomène de satiété grâce à l’activation de son récepteur (OB-R). Chez l’Homme, Il existe 4 isoformes du récepteur à la leptine obtenues par épissage alternatif du même gène (OB-Ra, b, c, et d). Elles ont toutes en commun leur domaine extracellulaire et membranaire mais divergent au niveau de la taille de leur domaine cytoplasmique. OB-Rb, la forme longue du récepteur, joue un rôle majeur dans l’obésité en activant les voies de signalisation responsable de l’homéostasie lipidique. OB-Ra, c, et d, les formes courtes ont un rôle encore mal connu. La Co-expression des formes courtes avec OB-Rb dans des tissus clé de l’obésité ainsi que leur grande homologie de séquence laissent penser à une interaction entre les isoformes. Il est bien établi que les récepteurs à la leptine homodimerisent de façon constitutive grâce à leur partie extracellulaire. Cependant, l’existence d’interactions entre la forme longue et les formes courtes d’OB-R n’a jamais pu être clairement démontrée malgré l’identité de séquence qui existe entre leurs domaines extracellulaires capables de dimériser même sous forme soluble. Nous avons donc entrepris de mettre en évidence cette interaction dans des cellules vivantes par l’utilisation du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). Cette technique repose sur la détection d’une interaction entre deux partenaires par un transfert d’énergie de type Förster entre un donneur et un accepteur d’énergie associés aux protéines d’intérêt. Comme attendu, les récepteurs à la leptine homodimerisent, mais hétérodimèrisent aussi. Nos résultats montrent que les isoformes courtes interagissent avec OB-Rb de manière constitutive dans des cellules vivantes. Ces interactions sont très instables et disparaissent lorsque les protéines sont solubilisées dans les mêmes conditions que lors des expériences de coimmunoprécipitation de récepteurs membranaires suggérant que l’absence de preuves antérieures de leur existence résulte probablement des techniques employées. De plus contrairement aux homodimères, alors qu’environ 90% des récepteurs sont à l’intérieur de la cellule, les interactions entre la forme longue et les formes courtes d’OB-R ne sont détectées qu’à la surface cellulaire où ils répondent à la leptine. Ceci suggère donc que ces complexes ne se forment qu’à la membrane plasmique et pourraient avoir un rôle fonctionnel dans les voies de signalisation. Ainsi nos résultats suggèrent que lors de la synthèse, les différentes isoformes d’OB-R s’associent en homodimères, atteignent la membrane et se regroupent en complexes formés de plusieurs homodimères. La leptine provoquerait non seulement un changement de conformation des homodimères comme déjà montré, mais également un rapprochement des homodimères entre eux au sein de ces complexes. En conclusion, cette existence d’oligomères entres les isoformes du récepteur à la leptine conduit à une réinterprétation des données de la littérature, et rend nécessaire un changement de la vision des fonctions des formes courtes et longues des OB-R et de leur impact dans l’obésité.


  • Résumé

    Leptin also called the satiety hormone is mainly produced by adipose tissue and regulate energy balance via the activation of its receptor (OB-R). In human, four isoforms of OB-R are produced by alternative splicing of a unique gene (OB-Ra, b, c, and d). These receptors share the same extracellular and transmembrane domain but have distinct cytoplasmic tails. While the long isoform OB-Rb, plays an essential role in obesity by regulating key signaling pathways implicated in lipid homeostasis, short isoforms (OB-Ra, c, d) functions are still unclear. Co expression of OB-Ra with OB-Rb in key tissue for regulation of obesity, and the shared extracellular and transmembrane domain between the different isoforms, allow us to investigate physical interaction between OB-R isoforms. It is well established that the shared extracellular domain of OB-R isoforms constitutively forms homodimers even in their soluble form. However, interactions between shorts and longs isoforms have not been clearly demonstrated and remain controversial. We have tried to demonstrate these interactions using the BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) technology. This method based on a Förster resonance energy transfer between an energy donor and an energy acceptor allows the monitoring of protein-protein interaction in living cells. Our results clearly demonstrate that the different OB-R isoforms homodimerize but also that shorts forms constitutively interact with OB-Rb in living cells. These are weak interactions, indeed disrupted when proteins are solubilized using similar experimental conditions used in co-immunoprécipitation of membrane receptor. The lack of evidence of these interactions in previous reports may then results from chosen methods and most particularly by the involved solubilization step. Unlike homodimers that are present in intracellular membrane and at the cell surface, shorts and longs isoforms are monitored only at the cell surface where they respond to leptin stimulation. This suggests that these complexes are only able to form at the plasma membrane and should have a functional role in signaling. Hence, our results suggest that OB-R isoforms form homodimers during biosynthesis, reach the cell surface where OB-R homodimers cluster in complexes. Leptin stimulation could lead to a conformational change in constitutive homodimers as previously shown, but also to a recruitment of preformed dimers in tetrameric complexes including some short and long isoforms dimers. To conclude, these OB-R heterodimers imply a critic discussion of published datas and may open new perspectives on the real impact of short and long OB-T isoforms on obesity.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (125 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 108-122

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  • Cote : 50.379-2010-13
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