Etude comparative structurale et fonctionnelle de CCL18 recombinant humain produit par la cellule CHO et E. Coli

par Benjamin Legendre

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Philippe Lassalle.

Soutenue en 2010

à Lille 2 .


  • Résumé

    En France, de 20 à 25% de la population générale souffre d’une maladie allergique. Les allergies respiratoires sont au premier rang des maladies chroniques de l’enfant. La prévalence de l’asthme est en constante augmentation, elle était de 2 à 3 % il y a 15 ans, contre 5 à 10% aujourd’hui. Près de 2000 décès sont recensés chaque année du fait d’un asthme, dont plus de 10% chez les enfants, les adolescents et les adultes de moins de 45 ans. L’asthme allergique implique la migration de cellules à profil Th2 ainsi que d’éosinophiles vers la muqueuse bronchique, qui jouent un rôle déterminant dans l’installation de l’inflammation chronique des voies respiratoires. Ce trafic leucocytaire est orchestré par un réseau complexe de chimiokines. Parmi celles-ci, CCL18 semble jouer un rôle clé. En effet, CCL18 est préférentiellement exprimé au niveau pulmonaire, essentiellement par les macrophages et les cellules dendritiques. Son expression est augmentée par des cytokines dites Th2, et est capable d’attirer et d’activer les lymphocytes Th2 et B, ainsi que les cellules dendritiques immatures. Bien que son récepteur n’a toujours pas été identifié, nous savons que la signalisation induite pas CCL18 est médiée par un récepteur couplé aux protéines G. A l’instar des autres CC-chimiokines, CCL18 possède potentiellement 2 ponts disulfures entre les cystéines Cys10-Cys34, et Cys11-Cys50, lui conférant sa conformation. CCL18 contient également une séquence consensus de fixation à l’héparine BBXB (ou B représente un acide aminé basique) qui permet de retenir la chimiokine à la surface cellulaire riche en glycosaminoglycanes. Cependant, CCL18 circule dans le flux sanguin à hauteur de 30 ng/mL chez les sujets sains, jusqu’à 75 ng/mL chez les patients asthmatiques, et à plus de 1000 ng/mL chez les patients atteints de la maladie de Gaucher. CCL18 a été purifié chez l’homme, et il a été montré qu’adjoint à la forme entière (1-69), mature, on retrouve diverses isoformes, tronquées en N (3-69 et 4-69) ou C terminal (1-68). De plus, le mélange des isoformes 1-69 et 1-68, obtenu à partir de plasma humain, a montré des propriétés chimiotactiques. Actuellement, le moyen le plus courant pour étudier le CCL18 est l’utilisation d’une chimiokine entière (1-69) produite par un organisme procaryote : E. Coli. Ainsi, nous avons voulu étudier les fonctions et la structure d’un CCL18 dérivé d’un organisme eucaryote (la cellule CHO), et les comparer à celles de la chimiokine dérivée de E. Coli. Nous avons montré que le CCL18 produit par la cellule CHO correspond bien à la forme entière 1-69, dont la masse concorde avec la masse théorique de CCL18 humain, à l’instar du CCL18 produit par E. Coli. Cependant, nous avons établi que le CCL18 produit par la cellule CHO présente bien 2 ponts disulfures entre les cystéines Cys10-Cys34, et Cys11-Cys50, alors que le CCL18 produit par E. Coli ne possède que le pont entre les cystéines Cys11-Cys50. Les tests en chimiotaxie sur des lymphocytes T naïfs et des basophiles, ainsi que les tests d’histaminolibération, ont montré que la concentration d’activité maximale de la CCL18 produit par la cellule CHO est de 10-9M, contre 10-7M pour la CCL18 produit par E. Coli. Nous avons également démontré que la réduction du pont Cys10- Cys34 dans la CCL18-CHO entraine la diminution de son activité biologique, à des niveaux équivalents de ceux observés pour la CCL18- E. Coli. Finalement, cette étude a permis de mettre en relief le lien direct entre l’activité biologique de la chimiokine et du premier pont disulfure de sa structure. Ce pont devenant par la même une cible potentielle dans la cascade de régulation de la chimiokine, et ouvrant de nouvelles perspectives pour l’identification de son récepteur


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  • Détails : 1 vol. (83-17 f.)
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  • Cote : 50.379-2010-4-C
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