Détection et identification de l'ADN dégradé : nouvelles approches moléculaires et biophysiques

par Maxime Mohamad Merheb

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Catherine Hänni.

Soutenue en 2010

à Lyon, Ecole normale supérieure .


  • Résumé

    Species identification is a key issue in many topical fields such as food forensics, medicine, paleontology, etc. . In processed products (animal or plant), identification based on morphological characters is not possible because no diagnostic test is available, hence the need to use identification methods based on DNA amplification by PCR (DNA barcoding). However, in degraded substrates, this molecule is sometimes unavailable to PCR due to the presence of inhibitors and / or chemical modifications that block the activity of Taq polymerase. In the first part, this thesis develops a methodology for extracting and amplifying DNA from leather, taken as a model of a product which is highly resistant to molecular analysis due to the treatments used in its manufacture. Indeed, the DNA in worked skin is highly degraded, chemically modified and more specifically it is co-extracted with inhibitors of PCR (dyes and tannins). In addition to the important applications in fraud prevention and biodiversity protection, restoration of historical musical instruments was an important goal of our approach. As new enzymatic treatments (DNA repair) are currently limited to already amplifiable DNA substrates, it is necessary to develop a new approach for DNA inaccessible by PCR. Thus, the second part of this thesis develops a new non-enzymatic method. This physical detection of DNA is based on vibrational Raman spectroscopy (SERRS, Surface Enhanced Resonant Raman Spectroscopy). In the future, this approach could replace the PCR, and be applied for rapid and reliable molecular diagnosis, especially in medical tests.

  • Titre traduit

    Detection and identification of degraded ADN : new molecular and biophysic approaches@


  • Résumé

    L'identification des espèces est une question essentielle dans de nombreux domaines actuels comme l'agro-alimentaire, la médecine, la paléontologie, etc. Dans les produits transformés (d’origine animale ou végétale), l’identification basée sur des caractères morphologiques n’est pas possible car aucun critère diagnostique n’est accessible, d’où la nécessité d’utilisation de méthodes d’identification basées sur l’amplification de l’ADN par PCR (DNA barcoding). Cependant, dans des substrats dégradés, cette molécule est parfois inaccessible à la PCR en raison de la présence d’inhibiteurs et/ou de modifications chimiques bloquant l’activité de la Taq polymérase. Dans une première partie, cette thèse développe une méthodologie d’extraction et d’amplification de l’ADN à partir des cuirs, pris comme modèle des produits les plus réfractaires à l’analyse moléculaire, du fait des traitements utilisés lors de leurs fabrication. En effet, l'ADN présent dans la peau travaillée est fortement dégradé et chimiquement modifié et en particulier il est co-extrait avec des inhibiteurs de la PCR (colorants et tanins). Outre des applications importantes dans la répression des fraudes et la protection de la biodiversité, la restauration des instruments historiques de musique a été un objectif important de notre approche. Comme les nouveaux traitements enzymatiques (réparation de l’ADN) sont pour l’instant limités aux substrats d’ADN déjà amplifiables, il est donc nécessaire de développer une nouvelle approche pour l’ADN inaccessible par la PCR. Dans ce but, la deuxième partie de cette thèse développe une nouvelle méthode non enzymatique. Il s’agit d’une détection physique de l’ADN, basée sur la spectroscopie vibrationnelle Raman (SERRS, Surface Enhanced Resonant Raman Spectroscopy). Dans l’avenir, cette approche pourrait remplacer la PCR, et être appliquée pour les diagnostics moléculaires rapides et fiables, en particulier pour les analyses médicales.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (146 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 135-146

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