Study of the molecular mechanisms by which microRNAs mediate translational régulation

par Emiliano Ricci

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Théophile Ohlmann.

Soutenue en 2010

à Lyon, Ecole normale supérieure , en partenariat avec Laboratoire de virologie humaine (Lyon) (laboratoire) .

  • Titre traduit

    Etude du mécanisme moléculaire par lequel les microARNs régulent la traduction des ARN messagers chez les eucaryotes


  • Résumé

    In animals, microRNAs (miRNAs) generally regulate gene expression by binding to the 3’ untranslated region (3’UTR) of messenger RNAs (mRNAs) and reducing their translation and/or stability. However, despite strong efforts carried out to dissect the mechanisms responsible for translational repression, the latter remains largely unknown. Here, we describe a new in vitro cell-free extract, which is based on the use of untreated rabbit reticulocyte lysate (RRL) and that faithfully recapitulates miRNA-mediated translational repression mediated by endogenous miRNAs. By performing microarray analysis of RNAs present within the untreated RRL we were able to characterize the presence of many endogenous miRNAs. Among these, we detected high amounts of let-7, as well as miR-451 (an erythroid specific miRNA). In addition to miRNAs, we also showed that RISC components such as Argonaute 2 and TNR6CA, together with Dicer, were present within the lysate. Using a series of reporter RNAs, we further showed that endogenous miRNAs were functional in repressing translation (in the case of partially complementarity target sites) but also in inducing the cleavage of target mRNAs (in the case of fully complementary target sites). Interestingly, translational repression occurred at very early times and was not linked to deadenylation or degradation of the target RNAs. Using this system, we undertook the study of the molecular mechanisms of translational repression mediated by miRNAs. We first, showed that translational repression was dependent on a competitive environment since nuclease-treated RRL, which also contains endogenous miRNAs, but lacks endogenous messenger RNAs, was not functional in mediating translational repression by miRNAs. Interestingly, addition of free poly(A) RNA was enough to restore a potent miRNA response in nuclease-treated RRL thus pointing out to the poly(A)-binding protein as a potential regulator of translational repression mediated by miRNAs. In agreement with this, removal or cleavage of PABP both led to a relief of translational repression in untreated RRL. In an attempt to understand the role of PABP in the repression pathway, our results further suggested that miRNAs impair ribosomal scanning in order to repress translation of target mRNAs. This regulation could occur through the disruption of the interaction between PABP and eIF4B (the initiator factor that stimulates the Helicase activity of eIF4A). Surprisingly, recognition of the cap structure, as well as the joining of 60S ribosomal subunits, two stages that have been previously described as regulated by miRNAs, did not appear to be targeted by miRNAs in our system.


  • Résumé

    Chez les animaux, les microARNs (miARNs) régulent l'expression des gènes en s'hybridant au niveau de la region 3' non traduite (3'UTR) des ARN messagers (ARNm) et en réduisant sa traduction et/ou sa stabilité. En dépit de nombreux efforts pour disséquer les mécanismes responsables de l'inhibition de la traduction induite par les miARNs, ces derniers demeurent largement incompris. Ici, nous décrivons un nouveau système in vitro qui utilise le lysat de réticulocytes de lapins non traité (RRL) et qui est capable de récapituler de façon physiologique, la répression traductionelle causé par des miARNs endogènes. En effet, grâce à l'utilisation de puces "microarray" contenant des sondes pour l'ensemble des miARNs connus chez les mammifères, nous avons caractérisé la prèsence de nombreux miARNs dans le RRL. Parmi ceux-ci, nous avons detecté de grandes quantités de let-7 et de miR-451 (un miARN spécifique à la lignée erythroïde). Par ailleurs, nous avons aussi mis en évidence, dans le RRL, la présence de plusieurs composant du "RNA-induced Silencing Complex" (ou RISC), tels que Argonaute 2 et TNR6CA, ainsi que Dicer. En utilisant, une série d'ARNm rapporteurs, nous montrons que les miARNs endogènes du RRL sont fonctionnels dans la répression de la traduction (dans le cas d'une complémentarité imparfaite avec l'ARN cible, mais étaient aussi capables d'induire le clivage de ce dernier (dans le cas d'une complémentarité parfaite). De façon intéresante, la répression traductionelle induite par les miARNs dans le RRL a lieu à des temps très courts et n'est pas liée à la déadénylation ou la dégradation des ARNm ciblés. En utilisant le RRL, nous avons entrepris l'étude des mécanismes moléculaires responsables de la répression traductionelle induite par les miARNs. Tout d'abord, nous avons montré que la répression traductionelle dépend d'un environnement compétitif pour la traduction, puisque le RRL préalablement traité à la nucléase microccocale (pour le débarasser des ARNm endogènes), ne récapitule pas l'effet miARN, bien qu'ayant les mêmes quantités de miARN endogènes. De façon intéresante, l'ajout d'ARN poly(A) suffit a elle seule, pour activer la réponse miARN dans le RRL non traité en laissant penser à un rôle de la protéine PABP dans la voie miARN. En acord avec cette hypothèse, la dépletion ou dégradation du PABP endogène du RRL conduisent à une perte de l'activité miARN. Dans un effort pour comprendre le rôle de PABP dans le mécanisme de répression des miARNs, nos résultats suggèrent que les miARNs agissent en inhibant le balayage des sous-unités 40S au niveau de l'initiation de la traduction. Un tel mécanisme pourrait s'expliquer par l'inhibition de l'activité hélicase du facteur d'initiation eIF4A dont l'activité est régulée par PABP et eIF4B (co-facteur de eIF4A). De façon surprenante, la reconaissance de la coiffe, ainsi que le recrutment de la sous-unité 60S (deux étapes décrites dans la litérature comme étant régulées par les miARNS) ne semblent pas régulées par les miARNs dans notre système d'étude.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (236, [50] p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 208-231

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