Effets du TNF-α et de l'IL-1β sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de la minéralisation physiopathologique

par Philippe Lencel

Thèse de doctorat en Aspects moléculaireset cellulaires de la biologie. Biologie cellulaire

Sous la direction de David Magne.

Soutenue en 2010

à Littoral .


  • Résumé

    La minéralisation de l'os et du cartilage de croissance représente le processus physiologique normal par lequel des cristaux de phosphate de calcium se forment et s'associent à une matrice collagénique pour aboutir à la formation d'un tissu osseux fonctionnel. Il a été récemment démontré que ces minéralisations reposent sur la simple coexpression de deux protéines relativement ubiquitaires, un collagène fibrillaire et la phosphatase alcaline non-spécifique du tissu (TNAP). La fonction de la TNAP dans la minéralisation consiste à hydrolyser les ions pyrophosphates qui sont de puissants inhibiteurs de la minéralisation. Outre ces minéralisations physiologiques, des minéralisations anormales se produisent fréquemment dans d'autres tissus, comme certaines artères ou certains tendons et ligaments par exemple. C'est notamment le cas chez les patients atteints d'athérosclérose, de diabète de type 2, dans certaines spondylarthropathies, ou simplement lors du vieillissement. Ces minéralisations, communément appelées calcifications ectopiques, semblent inévitablement se dérouler dans un contexte d'inflammation chronique. C'est bien sûr le cas pour les spondylarthropathies, mais également pour l'athérosclérose et le diabète de type 2, et même pour le vieillissement, pour lequel de nombreuses études ont montré une augmentation des taux sériques de plusieurs cytokines. Dans ce contexte, les objectifs recherchés étaient de déterminer les effets de deux cytokines majeures, le tumour necrosis factor (TNF)-alpha et l'interleukine (IL)-1beta sur les mécanismes de minéralisation physiopathologique. Dans des ostéoblastes dérivés de cellules souches mésenchymateuses humaines, nous avons observé par PCR quantitative que le TNF-alpha et l'IL-1beta diminuent l'expression du collagène de type I expliquant comment les cytokines inhibent la formation osseuse. A l'opposé, ces cytokines stimulent l'expression et l'activité de la TNAP et la minéralisation dans ces cellules. L'utilisation d'une lignée d'ostéoblastes humains surexprimant un dominant négatif de RUNX2 nous a permis de montrer que les effets sur la TNAP sont indépendants de ce facteur de transcription. Nous avons ensuite montré que l'expression de la TNAP dans les ostéoblastes était dépendante de l'activité constitutive de COX-2 et stimulée par le TNF-alpha via l'inhibition de PPARgamma. Nous avons alors formulé l'hypothèse selon laquelle les cytokines pourraient induire des calcifications ectopiques en stimulant la TNAP dans des tissus riches en collagène. Dans les cellules musculaires lisses humaines comme dans les ostéoblastes humains, nous avons observé que le TNF-alpha stimule la TNAP probablement via PPARgamma. L'inhibition du TNF-alpha et/ou de la TNAP pourrait donc représenter une approche thérapeutique intéressante dans le blocage des calcifications vasculaires. En revanche, nous avons observé que le TNF-alpha et l'IL1beta inhibent l'activité de la TNAP in situ dans des enthèses de tendons d'Achille murins, ainsi que dans des chondrocytes murins et humains in vitro. L'analyse des mécanismes impliqués suggère que le récepteur intracellulaire de la vitamine D3, activé par l'inhibition de PPARgamma, est responsable des effets différents en fonction du type cellulaire. En ce qui concerne l'inhibition de la TNAP dans les cellules des enthèses, les résultats obtenus corroborent les données cliniques qui indiquent que les anti-TNF sont sans effet sur la progression des ossifications pathologiques dans la spondylarthrite ankylosante, et suggèrent que la TNAP représente une cible plus pertinente que les cytokines TNF-alpha et IL-1beta pour bloquer ces ossifications. En conclusion, l'ensemble de ces travaux montrent des effets opposés des cytokines TNF-alpha et IL-1beta sur la TNAP en fonction des cellules et des types de calcification ectopique. Ces données permettent de mieux comprendre les effets de certains anti-cytokiniques sur la progression des ossifications ectopiques et suggèrent que la TNAP représente une cible commune prometteuse.

  • Titre traduit

    Effects of THF-alpha and IL-1Beta on the cellular and molecular mechanisms of pathophysiological mineralization


  • Résumé

    Mineralization in bone or growth plate cartilage represents the normal physiological process through which calcium phosphate crystals are formed and are deposited on a collagenous matrix to lead to the formation of a functional bone tissue. Recently, it was demonstrated that mineralization merely relies on the coexpression of two broadly expressed proteins : a fibrillar collagen and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP). TNAP’s function during mineralization consists in the hydrolysis of pyrophosphate ions, which are potent mineralization inhibitors. In additionto the normal mineralization process, pathological mineralization frequently occurs in other locations, like arteries or tendons and ligaments for instance. This is particularly the case in patients with atherosclerosis, diabetes type 2, spondyloarthropathies, or simply during aging. These calcifications, commonly called ectopic calcifications, appear to proceed in a context of chronic inflammation. This is obviously the case for spondylarthropathies, but also for atherosclerosis, diabetes type 2, and even aging, which is associated with increased serum levels of several inflammatory cytokines. In this context, our objectives were to determine the effects of two major cytokines, tumour necrosis factor (TNF)-alpha, and interkeukin (IL)-1beta on the mechanisms of pathophysiological mineralization. In oesteoblasts differentiated from human mesenchymal stem cells, quantitative PCR revealed that TNF-alpha and IL-1beta decrease the expression of collagen type I, thereby explaining why these cytokines inhibit bone formation. Experiments with an osteoblast cell line overexpressing a RUNX2 dominant negative construct indicated that effects of cytokines on TNAP expression were independent from this transcription factor. In human osteoblasts, we observed that TNAP expression is actually dependent of the constitutive expression of COX-2 and is increased by TNF-alpha throughinhibition of PPARgamma. We then formulated the hypothesis that TNF-alpha may induce ectopic calcifications in tissues enriched in a fibrillar collagen. In human vascular smooth muscle cells, we observed that TNF-alpha stimulates TNAP, also probably through PPARgamma inhibition. TNF-alpha and/or TNAP inhibition may therefore represent promising therapeutic targets to block vascular calcifications. In contrast, we observed that TNF-alpha and IL-1beta inhibit TNAP activity in situ in entheses from Achilles tendons in mouse, and also in murine and human chondrocytes in vitro. Analysis of the underlying mechanisms suggests that the intracellular receptor of vitamin D3, activated by PPARgamma inhibition, may be responsible for the opposite effects of TNF-alpha on TNAP expression depending on the cell type. Considering the effects of cytokines on TNAP activity in entheses, our results corroborate recent clinical data indicating that anti-TNF-alpha treatments are unable to block the progression of ossification in ankylosing spondylitis, and suggest that TNAP may represent a more promising target than TNF-alpha or IL-1beta to block excessive bone formation. In conclusion, our studies revealed opposite effects of TNF-alpha and IL-1beta on TNAP activity depending on the cell type and therefore the location of ectopic calcification. These data may allow a better understanding of the effects of anti-TNF-alpha treatments on the progression of ectopic ossifications and suggests that TNAP represents a promising target.

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  • Annexes : Bibliogr. f. 75-93.

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